許 棟，何 俊，賀長青，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

高通量測序技術(shù)在豬miRNA功能研究中的研究進(jìn)展

許 棟，何 俊，賀長青，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

miRNA的研究是近幾年生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，該文對miRNA的形成及作用機(jī)制進(jìn)行了論述。當(dāng)前研究miRNA最主要的手段是高通量測序技術(shù)，文章對該技術(shù)的起源、發(fā)展、原理、分類及近幾年在豬miRNA功能研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了基因組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，目前已成為豬轉(zhuǎn)錄組研究的重要手段，為豬的基因組學(xué)研究提供了一個(gè)高效的平臺，為當(dāng)前豬品種遺傳改良、輔助育種選擇工作提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

豬；高通量測序技術(shù)；miRNA

隨著人類基因組計(jì)劃（human genome projiect，HGP）的提出，數(shù)量龐大的基因組計(jì)劃需要更強(qiáng)大的技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)分析軟件，高通量DNA序列分析技術(shù)（High-throughput DNA sequence analysis technology）的突破，使得人類基因組計(jì)劃得以完成。該技術(shù)是基于Sanger的雙脫氧鏈終止法發(fā)展起來的，利用了DNA聚合酶的雙脫氧鏈終止原理來測定核苷酸序列。自從1993年在秀麗新小桿先蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA lin-4，基因的表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)了一個(gè)新的研究領(lǐng)域—microRNA調(diào)控。miRNA通過與靶基因的3’端堿基互補(bǔ)配對，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。在過去的十幾年間，整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)大多集中在對miRNA的研究上，一些新的研究技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

1 高通量測序技術(shù)

高通量DNA序列分析技術(shù)成為了挖掘miRNA的主要手段，但由于其成本高、耗時(shí)長、檢出效率低，市場上出現(xiàn)了一些改良后的新高通量測序平臺，如羅氏公司發(fā)開的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa Genome Analyzer技術(shù)、ABI公司的SOLID System技術(shù)等等，都是目前市場上運(yùn)用最廣泛的miRNA研究手段。這些測序技術(shù)被稱作下一代測序技術(shù)（Nextgeneration sequencing，NGS），又名深度測序技術(shù)（Deep Sequencing），屬于第二代測序技術(shù)。

羅氏公司于2005年推出的454測序技術(shù)開創(chuàng)了第二代測序技術(shù)的先河，該技術(shù)是基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)。454測序技術(shù)的原理是依靠一系列酶的協(xié)同作用，在每一輪測序反應(yīng)中只加一種dNTP，與模板配對就能釋放一次熒光信號，通過檢測熒光信號獲得DNA序列，其優(yōu)點(diǎn)是讀取序列長度可達(dá)600～1 000 bp，但是通量很低。此后，Illumina公司推出了Solexa Genome Analyzer技術(shù)，其主要原理是邊合成邊測序，在生成新的DNA互補(bǔ)鏈時(shí)，加入的dNTP通過酶促級聯(lián)反應(yīng)催化底物釋放出熒光信號，或者通過直接加入有熒光標(biāo)記的dNTP或半簡并引物，在合成互補(bǔ)鏈時(shí)發(fā)出熒光信息，利用采集到的熒光信號來獲得序列信息，其優(yōu)點(diǎn)是測序通量大，結(jié)果較準(zhǔn)確，但讀取序列長度通常只有100～200 bp。ABI公司研發(fā)的SOLID System技術(shù)，與焦磷酸測序的原理類似，主要采用雙堿基編碼的原理，通過寡核苷酸連接和熒光信號的檢測進(jìn)行測序，其結(jié)果的準(zhǔn)確率大大提高，但其讀取序列長度最短，僅50 bp左右。

第二代測序技術(shù)的出現(xiàn)大大減少了實(shí)驗(yàn)成本和縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，通過實(shí)驗(yàn)獲得的產(chǎn)物無需進(jìn)行電泳，直接通過收集的熒光信號值就能獲取序列信息，單次反應(yīng)中可以對大量的樣品進(jìn)行同時(shí)分析，這是傳統(tǒng)的測序儀所不能達(dá)到的，此外，也不用像基因芯片技術(shù)那樣需要設(shè)計(jì)探針，能在全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測和量化轉(zhuǎn)錄片段，并可用于研究基因組圖譜尚未完成的物種。第二代測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用到多個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域，如基因組重測序，基因組結(jié)構(gòu)變異、全基因組分型、miRNAs的挖掘等。轉(zhuǎn)錄組測序RNA-seq（RNA sequencing）就是基于深度測序技術(shù)的新一代高通量測序技術(shù)的代表，已廣泛用于挖掘新miRNAs的研究中，不僅可以對miRNAs的遺傳變異進(jìn)行檢測，同時(shí)也能檢測到miRNAs的表達(dá)豐度。

2 miRNA的形成及其作用機(jī)制

過去20年間最令人驚喜的生物發(fā)現(xiàn)之一就是非編碼RNA（noncoding RNA），miRNA長約22 nt，屬于非蛋白編碼的單鏈RNA，但能調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的miRNA由RNA聚合酶II編碼，miRNA被發(fā)現(xiàn)于不同的基因組區(qū)域：蛋白編碼基因的內(nèi)含子、非編碼基因的外顯子和內(nèi)含子和蛋白編碼基因的3’端區(qū)域。大約1/3哺乳動(dòng)物的miRNA嵌在蛋白編碼基因的內(nèi)含子上，且具有它們所存在的蛋白編碼基因相同的轉(zhuǎn)錄模式。根據(jù)計(jì)算預(yù)測發(fā)現(xiàn)人類有60%的蛋白編碼基因通過mRNA的3’端與miRNA上被稱為種子區(qū)域的5’端堿基配對受miRNA靶向，配對會抑制靶基因的翻譯和降解，從而控制基因表達(dá)。成千上百個(gè)靶基因會受同一個(gè)miRNA調(diào)控，同時(shí)幾個(gè)miRNA也可以靶向同一個(gè)轉(zhuǎn)錄子。幾乎所有類型的生物學(xué)過程都會被miRNA調(diào)控，如發(fā)育時(shí)間的控制、細(xì)胞增殖、胚胎干細(xì)胞分化、肢體發(fā)育、脂肪沉積、肌細(xì)胞生成、血管生成和造血作用、神經(jīng)發(fā)生、脂肪代謝、胰島素分泌乃至癌癥的形成。大多數(shù)miRNA家族在脊椎動(dòng)物中是保守的，所以它們的功能也很好地被遺傳下來。然而，也有研究表明在人和黑猩猩中發(fā)現(xiàn)了許多在哺乳動(dòng)物中并不保守的新miRNA，約有10%是物種特異性的。這種類型的研究已拓展到更多物種中，發(fā)現(xiàn)了大量的譜系特異性miRNAs和物種特異性miRNAs。這些結(jié)論表明，對單個(gè)生物體miRNA文庫的測序更有利于對保守和新的物種特異性miRNAs進(jìn)行鑒定和分類。計(jì)算方法能有效識別不同植物和動(dòng)物物種中的保守miRNAs，但是這種方法需要知道完整的基因組序列，若信息不全，物種特異性miRNAs不能被可靠地鑒定，直接對miRNA進(jìn)行測序是一種描述生物體基因組表達(dá)的miRNAs直接且有效的方法。

3 高通量測序技術(shù)在豬miRNA功能研究中的應(yīng)用

豬肉是世界上最廣泛的食用肉類。近年來，由于豬和人類在解剖學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)和藥理學(xué)上具有很多相似性，豬被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)研究的潛在模型系統(tǒng)。因此，豬可以為人類健康相關(guān)的研究提供一個(gè)全面系統(tǒng)的了解，如肥胖、糖尿病、癌癥、胃潰瘍、女性生殖健康、心血管疾病、傳染病、器官移植等方面。此外，豬在進(jìn)化上比小鼠更接近人類。豬的經(jīng)濟(jì)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)意義促進(jìn)了豬基因組測序聯(lián)盟（S wine Genome Sequencing Consortium，http：//www.piggenome.org/）的成立，以破譯豬的基因組序列。基因組序列和轉(zhuǎn)錄組分析大大提高了我們探索各種生物和生物醫(yī)學(xué)秘密的能力，從而更好地利用豬的商業(yè)性狀及有益于人類健康。miRNA和其靶基因的鑒定可以進(jìn)一步了解影響豬中各種生物和代謝過程的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制。

對于人和小鼠來說，目前miRBase數(shù)據(jù)庫（http：//www.mirbase.org/）收錄的豬miRNA數(shù)量并不多，至2014年7月，發(fā)現(xiàn)人的前體miRNA數(shù)1 181條，成熟miRNA數(shù)2 603條；小鼠的前體miRNA數(shù)為1 193條，成熟miRNA數(shù)1 920條；豬的前體miRNA數(shù)為382條，成熟miRNA數(shù)為430條。RNA-seq技術(shù)已運(yùn)用在豬的不同組織研究中，如骨骼肌、性腺、肝臟、脂肪組織、子宮內(nèi)膜上的研究結(jié)論使我們對豬的mRNA轉(zhuǎn)錄組有了更好的理解。miRNA在β細(xì)胞、肌肉細(xì)胞個(gè)脂肪細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起重要作用。通過微陣列芯片技術(shù)（Microarray chip technology）對骨骼肌中的整體miRNA豐度進(jìn)行了檢測，用以評價(jià)miRNA在豬發(fā)育和肉生產(chǎn)中作用。miRNA-seq技術(shù)為研究豬miRNA轉(zhuǎn)錄組提供了新的視野，尤其是通過Microarray分析未充分檢測到的miRNAs。目前為止，通過NGS對豬的腸道、產(chǎn)前和產(chǎn)后的仔豬、發(fā)育中的大腦和骨骼肌的miRNA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究。

最近大量研究利用高通量測序方法對豬組織特異性miRNA庫進(jìn)行檢測。McDaneld鑒定了豬骨骼肌中的基因表達(dá)情況，并預(yù)測了可能靶向這些基因的miRNA。Liu等研究氧化型和糖酵解型骨骼肌之間的差異，鑒定了不同肌纖維類型中觀察到的表型變異中發(fā)揮重要作用的miRNAs。分析了不同豬品種腎臟中表達(dá)的miRNAs，鑒定出了品種特異性miRNA，這些miRNAs可能與特定的品種表型有關(guān)。此外，豬牙齒中表達(dá)的miRNAs已被作為研究牙齒發(fā)育分子機(jī)制的工具；由于兩個(gè)物種的相似性，豬腸道中表達(dá)的miRNAs可用于研究人類腸道的病理過程。從豬大腦的miRNA表達(dá)譜中鑒定了在大腦發(fā)育過程中特異性激活的miRNAs。豬胚胎期的睪丸、卵巢和精細(xì)細(xì)胞的miRNAs表達(dá)對了解豬和其他動(dòng)物胚胎發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)制提供了有價(jià)值的資源。垂體腺通過特定的激素分泌來維持體內(nèi)的平衡：有研究表明腺體細(xì)胞能產(chǎn)生很多參與這個(gè)器官的發(fā)育和生理學(xué)過程的miRNA。Li等人在豬的肌肉和脂肪組織的比較研究中發(fā)現(xiàn)，兩種組織中檢測到的miRNA組成和表達(dá)水平存在巨大差異，說明皮下脂肪發(fā)育的基礎(chǔ)是由一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來實(shí)現(xiàn)。表觀遺傳因子（如miRNA、lncRNA和DNA甲基化）可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，是骨骼肌發(fā)育、代謝和其他過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。已有研究對豬骨骼肌中miRNA和lncRNAs做了全基因組分析，以研究豬骨骼肌的表型變異，并鑒定出了與肌肉發(fā)育相關(guān)的幾種miRNA和lncRNA，如miRNA-1、m i R N A-2 0 6、m i R N A-1 3 3、miRNA-155、miRNA-127、miRNA-148a、Malat1和H19。

4 高通量測序技術(shù)存在的問題及其展望

高通量測序技術(shù)近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的相當(dāng)迅速，特別是給基因組學(xué)的研究帶來了許多方向和思路，盡管如此，高通量測序技術(shù)依然存在一些不容忽視的局限性。第一，高通量測序技術(shù)只適合大規(guī)模的測序，其昂貴的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用對于一些小型簡單的測序來說并不合理，且一般的小型實(shí)驗(yàn)室也無法承受。第二，高通量測序后得到的數(shù)據(jù)量很大，后續(xù)的分析工作也是個(gè)難點(diǎn)。第三，高通量測序獲得的結(jié)果僅僅只是研究工作的開始，能用來說明生物學(xué)機(jī)制的數(shù)據(jù)還很有限，目前還只是初步獲得了基因組信息，其遺傳機(jī)制和通路還有待進(jìn)一步研究。

高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了基因組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，目前已成為豬轉(zhuǎn)錄組研究的重要手段，為豬的基因組學(xué)研究提供了一個(gè)高效的平臺，為當(dāng)前豬品種遺傳改良、輔助育種選擇工作提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

略，若有需要請與作者聯(lián)系

2017-02-21）

寧鄉(xiāng)花豬基礎(chǔ)研究（5026401-0315069）

許棟（1990.8-），女，漢，湖南岳陽人，博士在讀，就讀于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物遺傳育種與繁殖專業(yè)，豬的分子遺傳，E-mail：112668472@qq.com