刁巧虹，卞國志，王 娟，羅藹劍，張 瑩，高瀟祎，袁建豐，孫凌霜

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400；2.廣東海大集團股份有限公司，廣州 511400；3.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642）

·綜述·

奶牛乳房炎病原檢測技術研究進展

刁巧虹1,3，卞國志2,3，王 娟1,2，羅藹劍3，張 瑩3，高瀟祎3，袁建豐1,2，孫凌霜3

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400；2.廣東海大集團股份有限公司，廣州 511400；3.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642）

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最重要的疾病之一，不僅給奶牛業(yè)造成了巨大的經濟損失，而且其某些病原體可引起人類感染。引起奶牛乳房炎的病原多達150種，及時、準確的診斷乳房炎并檢測出致病菌，對奶牛乳房炎的綜合防治有著重要意義。目前，檢測乳房炎病原的方法主要有細菌分離鑒定法、免疫學檢測法、基因芯片和PCR檢測技術等。本文就奶牛乳房炎病原檢測技術進行系統闡述，旨在為奶牛乳房炎的綜合防治提供參考。

乳房炎；病原；檢測技術；奶牛

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最重要的疾病之一，不僅能引起產奶量及其品質下降，造成嚴重的經濟損失，而且患病奶牛所產牛奶中的某些病原體可引起人類感染。中國大部分地區(qū)奶牛乳房炎的檢出率在50%以上，而引起奶牛乳房炎的病原有細菌、病毒、真菌、支原體和綠藻等150多種。調查顯示最常見的致病菌有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和酵母菌等[1-3]。根據臨床表現可將奶牛乳房炎分為隱性型乳房炎和臨床型乳房炎。常用的診斷方法有體細胞直接計數法、CMT檢測法、黏度測試法、DNA含量測定法、ATP生物發(fā)光法技術、乳汁電導率的測定、乳汁pH值測定、乳成分直接檢測和MTT檢測法等，但是這些診斷方法都不能直接檢測出病原體的類型，難以對乳房炎的治療和預防提供及時確切的參考。目前能檢測乳房炎病原的方法主要有細菌分離鑒定法、免疫學檢測法、基因芯片和PCR檢測技術等。

1 乳汁中致病菌分離鑒定法

乳汁中致病菌的分離鑒定是傳統的奶牛乳房炎的診斷方法，主要包括無菌采集待檢乳樣，使用分離培養(yǎng)基和生化培養(yǎng)基進行分離鑒定，涂片染色、鏡檢和藥敏試驗等。細菌分離鑒定能夠詳細分析感染乳房炎的病原菌種類，確診不同類型的乳房炎，但該法耗時長，成本較高。

2 免疫學檢測法

根據抗原抗體特異性結合的反應特性，免疫學檢測法可用于特異性檢測乳汁中的病原，如檢測鏈球菌的乳膠凝集法[4]、免疫層析法[5]。免疫學檢測法具有較好的特異性和靈敏度，操作簡便，反應快，但易受環(huán)境及溶質的影響。

3 基因芯片技術

基因芯片由大量的DNA探針構成，可對多種病原微生物進行同時檢測，縮短了乳房炎診斷的時間。李秀萍等[6]建立的以16S rRNA為基礎的基因芯片技術，6～7 h即可檢測出金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、綠膿桿菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌6種牛乳房炎致病菌。邢會杰等[7]同樣以16S rRNA為靶基因構建了檢測無乳鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌和金黃色葡萄球菌的基因芯片方法，可以快速、特異、準確地對這4種菌株進行檢測和鑒定。Lee等[8]開發(fā)了可以檢測棒狀桿菌、牛支原體、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、牛鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌7種病原體的基因芯片。基因芯片技術具有方便、準確的特點，但是因其成本昂貴，且耗時相對較長，現階段難以投入臨床中使用。

4 多聚酶鏈式（Polymerase chain reaction，PCR）診斷法

4.1 普通PCR診斷法 自1985年PCR技術發(fā)明以來，憑借其快速、特異性強、敏感性高的特點，PCR檢測法已被廣泛運用于奶牛乳房炎病原微生物檢測。國內外現已構建了針對乳房炎主要致病菌的多種PCR檢測體系。Meiri-Bendek等[9]根據16S rRNA基因設計引物建立了無乳鏈球菌PCR檢測體系。陳玉霞等[10]根據16-23S rRNA之間的序列設計引物，建立了快速、特異的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌PCR檢測體系。李棟梁等[11]據產氣莢膜梭菌、乳酸乳球菌、變形桿菌、綠膿桿菌和腸球菌的16S rRNA分別設計了5對引物，進行PCR檢測，具有靈敏、高效的特點。普通PCR技術價格低廉，有著優(yōu)良的特異性和靈敏度，但是檢測病原單一。

4.2 多重PCR診斷法 引起奶牛乳房炎的病原菌種類多，且多呈混合感染，目前已有針對乳房炎主要致病菌構建的多重PCR診斷體系。高玉梅等[12]根據金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌16S-23S rRNA區(qū)域以及白色念珠菌18S rRNA序列設計了5對特異性引物，建立了有較好特異性的五重PCR技術。許信剛等[13]根據鏈球菌ef-tu基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、沙門氏菌hut基因和大腸桿菌23S rRNA基因序列，設計4對引物，構建了四重PCR體系。陳亞明等[14]根據無乳鏈球菌sip基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、大腸桿菌rrnB基因和蠟樣芽孢桿菌hblA基因構建四重PCR體系。Shome[15]對10種牛乳房炎的致病菌建立了多重PCR檢測體系。多重PCR體系可一次檢測多種病原，相對于普通PCR，雖其靈敏度有所下降，但其方便、省時、廉價的特點使其應用前景廣闊。

4.3 實時熒光定量PCR診斷法 實時熒光定量PCR（real-time PCR）是利用熒光信號監(jiān)測整個PCR擴增過程，通過建立標準曲線來對未知模板進行定量分析。劉繼超等[16]根據金黃色葡萄球菌腸毒素A基因序列，設計引物和Taqman探針，建立實時熒光定量PCR體系，其靈敏度達到1.3×102CFU/mL。Koskinen等[17]對鏈球菌、大腸桿菌和葡萄球菌等11個常見的病原進行熒光定量檢測，均具有很好的特異性和靈敏度。Singh等[18]構建了檢測李斯特菌和沙門氏菌的雙重實時熒光定量PCR體系。實時熒光定量PCR與普通PCR相比，靈敏度得到了一定的提升，且能定量檢測出乳房炎樣品中病原體數，可在一定程度上對乳房炎病程發(fā)展進行判斷。

4.4 可視化介導等溫擴增法 環(huán)介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技術是根據靶基因的6個區(qū)域設計4條引物，使用鏈置換DNA聚合酶，在恒溫的條件下擴增出LAMP特征性梯狀條帶[19]。LAMP在乳房炎的檢測上發(fā)展迅速，賀婷等[20]根據鏈球菌屬的特異性基因（tuf）設計一套LAMP引物，在水浴鍋中1 h內完成反應，其敏感性最高達到52 fg/μL。白智迪[21]根據牛支原體uvrC基因設計引物，在58℃下作用1 h，敏感度為3.4×101CFU/μL，特異性強。LAMP檢測法能快速得到肉眼可見的檢測結果，敏感性好，特異性強，操作簡便，為乳房炎檢測提供一個新的發(fā)展平臺。

5 結語

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最常見的疾病之一，影響牛奶的產量和質量。目前乳房炎病原菌的檢測方法中，細菌的分離鑒定是傳統的確診病原菌類型的方法，存在耗時長的缺點?；蛐酒夹g能同時檢測出大量病原，但耗時仍比較長，且成本昂貴，難以普及。PCR方法能夠準確鑒定致病菌，并且縮短了鑒定的時間，成本較低。多重PCR敏感性與普通PCR相比有所下降，但是可一次檢測多種病原，縮減了檢測時間和成本。實時熒光定量PCR能進行定性定量檢測，學者們將其與傳統的細菌分離鑒定方法做比較，證明了該法有良好的靈敏度和特異性[22]。LAMP法能夠在1 h內得出肉眼可見的結果，極大的縮短了檢測的時間，今后將會更廣泛的運用于乳房炎的檢測。隨著檢測技術的發(fā)展，相信未來可以研制出快速、靈敏性高、特異性強、操作便捷且廉價的早期奶牛乳房炎檢測方法。

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RESEARCH PROGRESS ON DETECTION OF DAIRY COW MASTITIS PATHOGENS

DIAO Qiao-hong1,3, BIAN Guo-zhi2,3, WANG Juan1,2, LUO Ai-jian3, ZHANG Ying3, GAO Xiao-yi3,YUAN Jian-feng1,2, SUN Ling-shuang3

(1.Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary, Guangzhou 511400, China; 2. Guangdong Haid Group Co., Limited,Guangzhou 511400, China; 3.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Mastitis is one of the most important diseases that cause signi fi cant economic loss in dairy industry. Some mastitis pathogens have importance of public health. There are more than 150 species pathogens that can cause mastitis. Attempts to diagnose and detect these pathogens timely and accurately have been of signi fi cance in comprehensive prevention of dairy mastitis. Currently, major methods for detection of mastitis include isolation and identification of pathogens, immunological assays, gene chip and PCR. This summary provides the systemic illustration on detection methods and measures for integrated control of mastitis in dairy cows.

Mastitis; pathogen; detection method; dairy cow

S852.4

A

1674-6422（2017）04-0076-04

2016-07-14

廣州市科技計劃項目（201510010250）；廣東省科技計劃項目（2014A020208052）；廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司自主項目

刁巧虹，女，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學專業(yè)

袁建豐，E-mail：yuanjf@haid.com.cn；孫凌霜，E-mail：lsun42013@scau.edu.cn