欒 磊 關(guān)淑芬 朱 越 楊可欣

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

不同程度病變宮頸組織miR-424表達(dá)水平及其臨床意義

欒 磊 關(guān)淑芬 朱 越 楊可欣

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

目的探討微小RNA(miR)-424在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌患者宮頸組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診并最終獲得宮頸組織病理學(xué)診斷的40～69歲女性患者，收集宮頸組織；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同病變程度宮頸組織中miR-424的相對(duì)表達(dá)水平并進(jìn)行比較。結(jié)果共收集129例不同程度病變患者的正常和病變宮頸組織樣本(CIN Ⅰ組25例，CIN Ⅱ組30例，CIN Ⅲ組28例，宮頸癌組46例)。不同病變程度宮頸組織中miR-424的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.009，P=0.000)，且隨著病變程度的增加，miR-424的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。miR-424高表達(dá)所占比例與宮頸組織病變程度相關(guān)(χ2=8.377，P=0.039)，而與人乳頭瘤病毒(HPV)感染情況不相關(guān)。結(jié)論miR-424在不同病變宮頸的表達(dá)水平存在差異，隨著宮頸病變程度的加重，其表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)，并且宮頸病變程度影響miR-424的表達(dá)水平。

微小RNA(miR)-424;宮頸組織

微小RNA(miRNA)是一種短鏈非編碼的小分子RNA，通過與靶基因轉(zhuǎn)錄生成mRNA的特異性結(jié)合來發(fā)揮基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物過程〔1〕。研究〔2〕表明，miR-424在高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和浸潤(rùn)性宮頸癌的宮頸脫落細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于低級(jí)別CIN和正常宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)。許君芬等〔3〕對(duì)正常宮頸和宮頸癌組織的miRNA表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，miR-424是表達(dá)下降最明顯的miRNA。本研究擬分析miR-424在不同病變程度宮頸組織中的表達(dá)及其與各臨床參數(shù)間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2013年7月至2015年12月來齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診并最終獲得宮頸組織病理學(xué)診斷的40～69歲女性患者129例，收集病變部分宮頸組織及其病變周圍正常宮頸組織用于miRNA檢測(cè)。組織標(biāo)本取出后立即放入液氮中并置于-80℃冰箱中保存，直至RNA提取。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往已被確診為CIN、宮頸癌或其他惡性腫瘤者；②既往行宮頸部分或全部切除而致的宮頸不完整者；③孕婦均知情同意。宮頸組織的病理學(xué)診斷是通過手術(shù)切除或?qū)m頸活檢獲取的宮頸組織經(jīng)過石蠟切片的蘇木素-伊紅(HE)染色，診斷依據(jù)2003年國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)出版(IARC)的乳房和女性生殖器官腫瘤的病理和遺傳學(xué)相關(guān)依據(jù)進(jìn)行診斷〔4〕。當(dāng)研究對(duì)象同時(shí)存在多級(jí)別宮頸病變時(shí)按最高級(jí)別入組。CIN Ⅰ組25例，CINⅡ組30例，CINⅢ組28例，宮頸癌組46例。平均年齡分別為(49.61±4.55)歲、(52.03±5.36)歲、(50.54±5.91)歲、(51.86±6.25)歲。4組年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.210,P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟 ①總RNA提?。喝〕隼鋬龅牟∽儗m頸組織及病變周圍正常宮頸組織進(jìn)行勻漿，采用Trizol法提取宮頸組織中的總RNA〔5〕；然后向提取出的RNA沉淀中加入10 μl焦炭酸二乙酯(DEPC)水(日本TaKaRa公司)，于冰上靜置30 min以充分溶解RNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：向200 μl的滅菌管中加入0.5 μg上述步驟提取的總RNA和適量DEPC水，使總體積為6.8 μl，70℃在PCR儀器上預(yù)變性10 min保持4℃；向上述完成預(yù)變性的滅菌管中繼續(xù)加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄酶(日本TaKaRa公司)0.8 ml，逆轉(zhuǎn)錄緩沖試劑(日本TaKaRa公司)2.0 ml，RNA酶抑制劑(日本TaKaRa公司)0.2 ml，各基因RT引物0.2 ml，使總體積為10 μl；在PCR儀(美國(guó)BioRAD公司)中完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ forever。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR：向96孔板(美國(guó)Axygen公司)中加入qPCR反應(yīng)體系(上、下游引物各0.4 μl，2×SRBR Premix Taq 10 μl，Rox reference Dye 2 0.4 μl，3H2O 7.8 μl，cDNA模板1.0 μl)，使總體積為20 μl；反應(yīng)程序：95℃ 30 s，(95℃ 5 s + 60℃ 30 s)×40 個(gè)循環(huán)，其中，SRBR Premix Ex Taq試劑盒來源于日本TaKaRa公司。U6上游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,下游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-5′；miR-424上游引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCA AA-3′，下游引物：5′-CGAAGCAGCAGCAATTCATG-3′。

1.3結(jié)果判讀 采用7900HT快速實(shí)時(shí)系統(tǒng)自帶的SDS軟件進(jìn)行結(jié)果分析。用2-△Ct代表miRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中△Ct=Ct(miRNA)-Ct(U6),以U6作為對(duì)照。數(shù)值越大表示檢測(cè)的miRNA的相對(duì)表達(dá)水平越高，越小表示相對(duì)表達(dá)水平越低。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-424在宮頸組織中的表達(dá) 除CIN Ⅰ組外，CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組和宮頸癌3組正常宮頸組織與病變組織中miR-424表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且病變組織中miR-424的表達(dá)水平均低于正常組織。在正常宮頸組織中miR-424的表達(dá)在各組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在病變宮頸組織中miR-424表達(dá)水平在CIN Ⅰ組與CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組與宮頸癌組差異顯著(P<0.05),而CINⅡ組與CINⅢ組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2Spearman相關(guān)分析 miR-424在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和宮頸癌中的表達(dá)具有相關(guān)性(r=-0.784，P<0.05)，且隨著宮頸病變程度的加重，miR-424的相對(duì)表達(dá)水平顯著性降低。

表1 各組正常、病變宮頸組織miR-424表達(dá)情況

2.3miR-424相對(duì)表達(dá)水平與不同程度宮頸病變患者臨床資料的關(guān)系 不同程度病變宮頸組織中病變組織/正常組織比值≥0.5為miR-424高表達(dá)；<0.5為低表達(dá)〔5〕。在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和宮頸癌4組宮頸組織中，miR-424低表達(dá)所占比例分別為52.0%(13例)、63.3%(19例)、75.0%(21例)、82.6%(36例)。miR-424的表達(dá)情況與宮頸病變程度顯著相關(guān)(χ2=8.377，P=0.039)。此外，miR-424的表達(dá)情況與患者人乳頭瘤病毒(HPV)感染情況不相關(guān)(χ2=2.553,P=0.110)，其中HPV+97例，低表達(dá)72例；HPV-32例，低表達(dá)19例。

3 討 論

宮頸癌的發(fā)病過程漫長(zhǎng)，一般按順序要經(jīng)歷HPV感染、不同程度的CIN，最后發(fā)展為宮頸癌，該過程平均需要5～20年。由于宮頸易于暴露和取材，結(jié)合宮頸癌的高發(fā)生率和較漫長(zhǎng)的發(fā)病過程，監(jiān)測(cè)宮頸不同程度病變的生物標(biāo)志物(如miRNA)的發(fā)現(xiàn)可為宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供依據(jù)。

miRNA是廣泛存在的由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。它通過與靶mRNA分子的3′-UTR特異性互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種重要的生物學(xué)過程〔6〕。miRNA的異常表達(dá)廣泛參與多種腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控，它通過對(duì)體內(nèi)促癌或抑癌基因表達(dá)的調(diào)控來發(fā)揮作用。

目前研究顯示miR-424在胃癌〔7〕、結(jié)直腸癌〔8〕、原發(fā)性肝細(xì)胞癌〔9〕、前列腺癌〔10〕等癌組織中的表達(dá)異常，提示miR-424可能參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Cheung 等〔11〕采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)在高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸組織中的202個(gè)miRNAs進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了12個(gè)高度差異表達(dá)的miRNAs，其中包括miR-424，并且它在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和正常宮頸組織中的表達(dá)也存在差異。許君芬〔12〕研究發(fā)現(xiàn)miR-424在宮頸癌組織中的表達(dá)較宮頸正常組織顯著下調(diào)。以上研究提示miR-424在宮頸癌及其癌前病變組織中差異表達(dá)。本研究結(jié)果與Cheung等〔11，12〕研究結(jié)果一致，即miR-424在宮頸癌組織中的表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果提示miR-424可作為一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，用于宮頸病變的檢測(cè)。

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〔2017-02-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

欒 磊(1978-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科醫(yī)療研究。

R737.33

A

1005-9202(2017)17-4313-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.069