毛愛(ài)民 楊芝芬 馮嘉林 陸宇超 金嘉旻 韓奇宏

(無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無(wú)錫 214021)

生豬偽狂犬病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

毛愛(ài)民 楊芝芬 馮嘉林 陸宇超 金嘉旻 韓奇宏

(無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無(wú)錫 214021)

豬偽狂犬病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，該病實(shí)驗(yàn)室主要診斷技術(shù)有病毒分離鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、家兔接種試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、膠乳凝集試驗(yàn)等。本文重點(diǎn)介紹了病毒分離鑒定、家兔接種試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)三種方法，同時(shí)針對(duì)解剖技術(shù)、病理變化進(jìn)行了相關(guān)技術(shù)分析。

偽狂犬病 gB抗體 gE抗體 病理

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PrV）引起的豬的急性傳染病，也稱奧耶斯基氏病（Aujeszky's disease），該病在豬呈爆發(fā)性流行，引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎，公豬不育，新生的仔豬大量死亡，育肥豬呼吸困難、生長(zhǎng)停滯等，臨床上以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎和神經(jīng)節(jié)炎為特征，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。

該病可根據(jù)臨診癥狀，結(jié)合流行病學(xué)，可做出初步診斷，確診必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。主要診斷技術(shù)有病毒分離鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、家兔接種試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、膠乳凝集試驗(yàn)等，其中前三種適用于偽狂犬病毒檢測(cè)，中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于狂犬病免疫抗體和非免疫抗體檢測(cè)，最后一種適用于實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)早期進(jìn)行偽狂犬病抗體檢測(cè)。目前，常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方式為病毒分離鑒定、家兔接種試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。

1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是診斷偽狂犬病的可靠方法。患病生豬的腦、心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、鼻咽分泌物等均可用于病毒的分離的病料組織，但以腦組織和扁桃體最為理想。病料處理后可直接接種敏感細(xì)胞，如豬腎傳代細(xì)胞（PK-15和IBRS-2）、倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞（BHK-21），將病料按國(guó)標(biāo)方法處理接種后進(jìn)行培養(yǎng)，接種后36～72h內(nèi)可出現(xiàn)典型的細(xì)胞變圓、拉網(wǎng)、脫落等病變效應(yīng)。若初次接種無(wú)細(xì)胞病變，可盲傳3代，如仍無(wú)細(xì)胞病變，則判為偽狂犬病毒檢測(cè)陽(yáng)性。

2 家兔接種試驗(yàn)

采取病豬腦組織、扁桃體、淋巴結(jié)等，混合剪碎、研磨，用生理鹽水制成10%乳懸液，同時(shí)每1ml加青、鏈霉素各1000IU，離心取上清液接種于家兔皮下，每只2ml（用于接種的家兔必須事先用中和試驗(yàn)、膠乳凝集試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn)等檢測(cè)偽狂犬病病毒抗體陰性者才能使用），家兔經(jīng)1～2d注射部位出現(xiàn)奇癢，家兔先用舌舔接種部位，以后用力撕咬接種部位，使接種部位被撕咬傷、鮮紅、出血，持續(xù)4～6h，病兔衰竭，倒臥于一側(cè)，痙攣，呼吸困難而死亡，為偽狂犬病毒感染陽(yáng)性。如接種家兔仍健活，為陰性。

3 ELISA試驗(yàn)

因目前我國(guó)豬場(chǎng)使用的豬偽狂犬病疫苗基本都是gE基因缺失苗，因此可以用ELISA抗體檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行野毒感染鑒別和免疫抗體水平監(jiān)測(cè)，其中偽狂犬病gE抗體檢測(cè)盒檢測(cè)豬血清中是否存在gE野毒抗體，鑒別有無(wú)感染偽狂犬病野毒，偽狂犬病gB抗體檢測(cè)盒主要檢測(cè)偽狂犬免疫抗體水平，但分析前提是群體gE陽(yáng)性很低或均為陰性（如果gE抗體陽(yáng)性，則gB抗體有部分來(lái)自野毒感染后產(chǎn)生的抗體），只有很高的偽狂犬抗體才可以抵抗偽狂犬病毒的感染（gB陽(yáng)性率＞90%、離散度＜40），同時(shí)高抗體可以降低偽狂犬排毒。該方法是豬場(chǎng)特別是種豬場(chǎng)進(jìn)行偽狂犬病凈化的主要檢測(cè)技術(shù)，具體操作方法見(jiàn)檢測(cè)盒說(shuō)明書(shū)。對(duì)于兩種檢測(cè)盒可出現(xiàn)3種情況，分別為：gB-、gE-，沒(méi)有免疫，沒(méi)有感染；gB+、gE-，免疫合格，沒(méi)有感染；gB+、gE+，感染（免疫或未免疫）。而gB-、gE+，是不可能出現(xiàn)的。

4 病死豬解剖技術(shù)

偽狂犬病死豬如要做病毒分離、家兔接種、病理分析等實(shí)驗(yàn)，必須要掌握病死豬解剖技術(shù)。要按下列步驟依次進(jìn)行：進(jìn)行外部檢查、固定剖腹檢查臟器、腹腔器官的采出與檢查、胸腔剖開(kāi)與各器官的檢查、顱腔剖開(kāi)、口腔和頸部器官采出。在做解剖工作的同時(shí)一定要注意以下事項(xiàng)：一是在豬死亡以后，尸體剖檢進(jìn)行越快、準(zhǔn)確診斷的機(jī)會(huì)越多。夏季須在死后4～8h之內(nèi)完成，冬季不得超過(guò)18～24h。二是剖檢中要做記錄和拍照，將每項(xiàng)檢查的各種異常現(xiàn)象詳細(xì)記錄下來(lái)，同時(shí)將肉眼病變組織拍照，以便做出初步診斷。三是剖檢過(guò)程中要注意個(gè)人防護(hù)，穿好防護(hù)服、帶好口罩、手套，防止感染。四是尸體剖檢后要進(jìn)行無(wú)害化處理，如深埋、焚燒等。剖檢完后所用的器具、臺(tái)面、地面等都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理。

5 病理變化

我國(guó)2011年后產(chǎn)生豬偽狂犬病毒株經(jīng)國(guó)內(nèi)各科研院所的專家團(tuán)隊(duì)深入研究，推測(cè)為變異毒株，因此為了更好地進(jìn)行生豬偽狂犬病診斷分析，動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心在以豬主要病原均為陰性的仔豬為基礎(chǔ)上建立的豬偽狂犬病毒變異株單因子發(fā)病模型實(shí)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)來(lái)看病理肉眼變化明顯的器官主要有：腦組織水腫；腎臟紅色針尖狀出血點(diǎn)，有的腫大，有黃疸；扁桃體出血，有兩頭有潰瘍；肝臟：出現(xiàn)白色針尖狀壞死點(diǎn)；肺臟：出血，水腫；淋巴結(jié)腫大出血。取病變組織，常規(guī)石蠟切片，HE染色，鏡檢主要組織病理變化。病死豬主要變化為：肝臟的門(mén)靜脈、匯管區(qū)以及竇狀隙瘀血，并伴有肝小葉的大量出血，干細(xì)胞變性壞死；肺臟的肺泡內(nèi)大量出血，肺間質(zhì)增寬；腦內(nèi)呈現(xiàn)噬神經(jīng)元現(xiàn)象等非化膿性腦炎典型病變；脾臟：淋巴細(xì)胞缺失，有壞死灶。

[1]宣長(zhǎng)和，馬春全.豬病學(xué)（第三版）[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010.

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目“生豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)的推廣應(yīng)用”，合同編號(hào)：SXGC[2015]024。