龍冬梅，湯德元，黃 濤，王 彬，曾智勇，胡玲玲，石遠(yuǎn)菊，葉 麗，楊 偉，韋冠東

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬圓環(huán)病毒病2型診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

龍冬梅，湯德元*，黃 濤，王 彬，曾智勇，胡玲玲，石遠(yuǎn)菊，葉 麗，楊 偉，韋冠東

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬圓環(huán)病毒(PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的脊椎動(dòng)物病毒，可引起斷奶仔豬進(jìn)行性消瘦、淋巴組織等組織病變的一種多系統(tǒng)衰竭綜合征的重要傳染病，臨床上主要與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、仔豬先天性震顫（CT）、壞死性間質(zhì)性肺炎（PNP）及母豬繁殖障礙等疾病有關(guān)。根據(jù)病毒致病性的差異，以及核苷酸序列和抗原性的不同，將豬圓環(huán)病毒分成無(wú)致病性的豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和具有致病性的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）。本文從病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等方面綜述了當(dāng)前國(guó)內(nèi)外PCV2常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究進(jìn)展，可為臨床上豬圓環(huán)病毒病的確診提供參考。

豬圓環(huán)病毒2型；病原學(xué)診斷；血清學(xué)診斷；分子生物學(xué)診斷；快速檢測(cè)技術(shù)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是1974年德國(guó)學(xué)者Tischer從PK15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種不產(chǎn)生細(xì)胞病變的污染病毒，開(kāi)始一直未被重視，所以在豬群中廣泛傳播。直到1982年Tischer等[1]通過(guò)實(shí)驗(yàn)分離鑒定了該病毒后將其命名為豬圓環(huán)病毒，PCV隸屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，基因組為單股單股負(fù)鏈閉合環(huán)狀DNA病毒。病毒粒子直徑為14～25 nm，為二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的脊椎動(dòng)物病毒。根據(jù)其致病性、抗原性以及核酸序列的不同，將其分為無(wú)致病性的PCV-1型和致病性的PCV2型。兩種基因型的基因組序列長(zhǎng)度不一樣，前者為1 759 bp，后者為1 767 bp或1 768 bp。現(xiàn)在許多國(guó)家的豬圓環(huán)病毒感染都是PCV2感染。PCV2在臨床上主要與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、仔豬先天性震顫（CT）、壞死性間質(zhì)性肺炎（PNP）、母豬繁殖障礙等疾病有關(guān)。此外，PCV2還侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增加其他病毒和細(xì)菌感染的幾率，從而導(dǎo)致豬群的死亡率增加。近年來(lái)PMWS在我國(guó)豬群中呈流行趨勢(shì)，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。由于豬群中普遍存在PCV抗體，血清學(xué)診斷結(jié)果并不準(zhǔn)確可靠，所以本病的診斷工作一般都在病豬死亡后進(jìn)行。同時(shí)，PMWS的癥狀和病變與豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)基本相似，所以?xún)H憑癥狀、病理變化及流行病學(xué)調(diào)查很難做出準(zhǔn)確的判斷。目前，對(duì)PCV2的診斷主要是先通過(guò)臨床癥狀結(jié)合病理變化進(jìn)行初步判定，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)來(lái)確診。本文將主要對(duì)PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行綜述，以便為臨床上豬圓環(huán)病毒病2型的確診提供依據(jù)。現(xiàn)將豬圓環(huán)病毒病2型診斷技術(shù)綜述如下。

1 病原學(xué)診斷

1.1 病毒的分離鑒定

采集PMWS病死豬肺、肝、脾、扁桃體及淋巴結(jié)等組織研磨制成病料與PBS液體積比為1：5的懸液，在-20 ℃反復(fù)凍融3次后12 000 r/min離心20 min，取上清液用220 nm濾器過(guò)濾后接種于已長(zhǎng)成單層且無(wú)PCV污染的PK-15細(xì)胞，37 ℃吸附1 h（期間每15 min輕搖一次），然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)24 h后倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用300 mmol/L D-氨基葡萄糖處理后用pH為7.4的10 mmol/L無(wú)菌PBS洗滌2次，然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM細(xì)胞維持液，37 ℃培養(yǎng)48～72 h后傳代培養(yǎng)，12 h后用300 mmol/L D-氨基葡萄糖溶液處理30 min，棄去D-氨基葡萄糖用pH為7.4的10 mmol/L無(wú)菌PBS洗滌2次，然后加入10%胎牛血清的MEM細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，因?yàn)镻CV2接種細(xì)胞后不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），需連續(xù)盲傳1-3代后進(jìn)行PCV2抗原或核酸的檢測(cè)加以鑒定，也可用免疫熒光技術(shù)（IFA）檢測(cè)病毒的生長(zhǎng)情況，或者借助電鏡技術(shù)和超薄切片法來(lái)觀察PCV病毒粒子。本方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于臨床上疾病的快速診斷。

在我國(guó)，郎洪武等[2]用豬腎傳代細(xì)胞Dulac株分離到了2株豬圓環(huán)病毒。湯德元等[3]將貴州分離到的豬圓環(huán)病毒提取的DNA通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增PCV ORF2基因，克隆到pMD19-T載體并測(cè)序，后將構(gòu)建好的T載體雙酶切，然后將回收的目的片段與pET-32a(+)載體及pcDNA3.1(+)載體連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞TOP10中構(gòu)建原核及真核表達(dá)載體，并將ORF2基因插到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-2上，構(gòu)建以IL-2融合表達(dá)真核載體。結(jié)果表明：克隆的PCV ORF2基因全長(zhǎng)為719 bp，ORF為702 bp，編碼233個(gè)氨基酸，與GenBank公布的PCV ORF2基因的核苷酸同源性為98.4%。國(guó)內(nèi)很多研究人員分別從各地的病豬上分離到了多株豬圓環(huán)病毒。

1.2 電鏡觀察法

利用電鏡技術(shù)將感染豬淋巴或病毒細(xì)胞培養(yǎng)物制成切片在電鏡下觀察，則可從平面上觀察到病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，形態(tài)大小，復(fù)制方式等，再結(jié)合病毒自身所具有的形態(tài)、大小及結(jié)構(gòu)等不同特征即可對(duì)觀察到的病毒做出準(zhǔn)確的判斷。

G W Steveson等[4]在透射電鏡下觀察感染PCV2的PK-15細(xì)胞，將細(xì)胞病毒液反復(fù)凍融3次，8 000 r/ min離心30 min后棄沉淀再將上清液40 000 r/min超速離心3 h，棄掉上清液，用0.01 mol/L pH 8.0的TE緩沖液重懸沉淀并收集，通過(guò)透射電鏡觀察到了PCV2，并首次詳細(xì)描述了細(xì)胞的胞漿與細(xì)胞核內(nèi)的病毒包涵體及病毒粒子的形態(tài)。

2 血清學(xué)檢測(cè)

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果的一種方法。這種方法特異性高、敏感性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、可一次檢測(cè)大批量的樣品，既可以檢測(cè)抗原，又可以檢測(cè)抗體，是目前應(yīng)用最多最廣也是發(fā)展最快的檢測(cè)方法。

2000年，郎洪武等[2]用加拿大的PCV2克隆化特異性表達(dá)抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清，按照常規(guī)方法進(jìn)行PMWS抗體的檢測(cè)，將被檢血清按1：400稀釋?zhuān)?yáng)性和陰性對(duì)照血清按1：100稀釋?zhuān)?dāng)被檢樣品的OD值是陽(yáng)性對(duì)照OD值的3倍時(shí)判為陽(yáng)性，否則為陰性，此方法證明ELISA的靈敏度比較高。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

2000年，Walker等[5]首次利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA（C-ELISA）方法來(lái)檢測(cè)PCV2抗體。利用細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2作為抗原，PCV2特異性單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)試劑，成功建立了C-ELISA，將此法與間接免疫熒光方法相比較，結(jié)果表明C-ELISA方法的檢出率為99.58%，高于間接免疫熒光方法的97.14%，證明此方法與間接免疫熒光相比更加敏感，可用于PCV抗體的大規(guī)模監(jiān)測(cè)。

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)

間接免疫熒光技術(shù)（IFA）是一種比較特異的血清學(xué)方法，主要用于病毒分離效果的鑒定及監(jiān)測(cè)病變組織或豬源細(xì)胞PCV的感染情況，其特點(diǎn)是快速、特異、敏感、花費(fèi)少，既可以檢測(cè)豬群特異性抗原又可以檢測(cè)特異性抗原，應(yīng)用較廣泛。

2004年，Racine S[6]等將PCV2 IAF-2897株的ORF2克隆入真核表達(dá)載體pCEP5中，并獲得了大量的表達(dá)，他們用IFA技術(shù)對(duì)PMWS豬場(chǎng)的44份血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果15份為PCV2陽(yáng)性，檢出率為57.1%。2002年，我國(guó)的蘆銀華等[7]也應(yīng)用間接熒光技術(shù)對(duì)幾個(gè)地區(qū)的64份臨床血樣進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果38份血清呈現(xiàn)PCV抗體陽(yáng)性（59%），這表明PCV已在我國(guó)普遍流行。

2.4 抗原捕獲ELISA

Mcneilly F等建立了抗原捕獲ELISA方法用來(lái)診斷PMWS。在與病毒分離、IHC和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)等方法的比較中，除PCR外，其他方法均可鑒別PWMS與PCV2的亞臨床感染。

周松海[8]將純化得到的高純度單克隆抗體包被在96孔酶標(biāo)板上，0.5% BSA封閉后加入到Cap蛋白中，Cap蛋白與包被的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)也結(jié)合在酶標(biāo)板上，可以用來(lái)檢測(cè)血清中的PCV2抗體。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行摸索優(yōu)化，確定包被抗體的最佳稀釋度為1∶3 200，與之結(jié)合的Cap蛋白最佳稀釋度為1∶2 000（即濃為3.52 μg/mL），被檢血清最佳稀釋度為1∶40，鼠抗豬酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶16 000，以此建立的捕獲ELISA方法的臨界值為0.2，即若血清樣品OD630nm值大于0.2則判為陽(yáng)性，反之則判為陰性。對(duì)建立的捕獲ELISA方法進(jìn)行敏感性、特異性和重復(fù)性研究，確定此方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性。

2.5 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)(ICGT)的原理是用紅色膠體金為標(biāo)記物，以微孔濾膜為載體，通過(guò)滲濾而逐步反應(yīng)，3～5 min便可完成整個(gè)反應(yīng)。王慧杰等[9]通過(guò)克隆和表達(dá)豬圓環(huán)病毒Cap蛋白基因的羧基端，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)，建立了PCV2 Cap抗體膠體金檢測(cè)方法。用ELISA驗(yàn)證結(jié)果顯示表達(dá)蛋白免疫原性較強(qiáng)且能準(zhǔn)確地區(qū)分PCV2的陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，與豬其他病毒免疫血清無(wú)交叉反應(yīng)，其檢測(cè)靈敏度與ELISA相似。

2.6 免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)

免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)方法基本原理是將生長(zhǎng)有PCV的PK-15細(xì)胞在96孔板上長(zhǎng)成單層后，加入10倍稀釋的待檢豬血清，作用一段時(shí)間后吸干（或拍干）洗滌，再加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的豬IgG抗體，37 ℃孵育30 min，吸干（或拍干）洗滌后加入底物溶液顯色，然后終止反應(yīng)以檢測(cè)血清中的抗體。黃立平等[10]建立了一種檢測(cè)PCV-1血清抗體的IPMA方法。利用該方法對(duì)257份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PCV1和PCV2陽(yáng)性率分別為19.1%和80.5%，且PCV1陽(yáng)性血清中有95.9%為PCV2陽(yáng)性，表明臨床上PCV1與PCV2在豬群中混合感染程度高。劉長(zhǎng)明等[11]將IPMA方法改進(jìn)后，研制出一種新的IPMA抗體檢測(cè)試劑盒，適用于豬血清中PCV2抗體檢測(cè)，且該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)組織病料或細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒核酸，主要包括PCR診斷技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù) (FQ-PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性((PCRRFLP)、原位雜交實(shí)驗(yàn)（ISH）、基因芯片檢測(cè)技術(shù)(DNA chip)和核酸雜交檢測(cè)技術(shù)等方法。分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有簡(jiǎn)單方便、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。

3.1 PCR診斷技術(shù)

3.1.1 常規(guī)PCR診斷方法

常規(guī)PCR檢測(cè)是一種簡(jiǎn)便、快速、特異的診斷方法。利用Primer等軟件設(shè)計(jì)一對(duì)PCV2特異性引物，可直接從經(jīng)過(guò)處理的病料或細(xì)胞中擴(kuò)增出PCV2特異的基因組片段，以達(dá)到特異檢測(cè)PCV2感染的目的。

湯德元等[12]應(yīng)用血清學(xué)檢測(cè)和PCR/RT-PCR檢測(cè)對(duì)某規(guī)?；i場(chǎng)病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR/RT-PCR結(jié)果顯示該豬場(chǎng)為PCV2與豬流感病毒（SIV）混合感染。胡玲玲等[13]通過(guò)臨床癥狀觀察、病理剖檢及PCR檢測(cè)等方法進(jìn)行診斷，確診貴州省某規(guī)?；i場(chǎng)母豬產(chǎn)死胎、產(chǎn)后仔豬腹瀉、發(fā)病仔豬死亡是豬圓環(huán)病毒2型感染所引起的。

3.1.2 多重PCR診斷方法

多重PCR（Multiplex PCR）是一種特殊的PCR技術(shù)，它可以同時(shí)檢測(cè)2種或2種以上的病毒DNA/RNA，即在同一反應(yīng)中加入多對(duì)引物，可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因片段。該方法方便、簡(jiǎn)單、快捷，已廣泛應(yīng)用于疾病的快速診斷。

崔尚金等[14]根據(jù)GenBank中20株P(guān)CV2核苷酸序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立了能同時(shí)區(qū)分PCV1和PCV2的多重PCR方法，且該方法具有良好的特異性和敏感性。

湯德元等[15]根據(jù)GenBank登錄的病毒相關(guān)基因序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可同時(shí)檢測(cè)PCV2、偽狂犬病毒（PRV）和豬細(xì)小病毒（PPV）三種病毒的檢測(cè)方法，三種核酸檢測(cè)的最低濃度為2.2×10-3、2.5×10-2和3.7×10-2ng，證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性。

3.1.3 巢式PCR

巢式PCR（nested PCR）和常規(guī)PCR及多重PCR相比更加敏感，當(dāng)組織病料或細(xì)胞中的PCV2模板DNA含量太少時(shí)，用這一方法檢測(cè)比較靈敏。

Kim J等[16]于2001年建立了巢式PCR方法，他們從福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織中檢測(cè)到了PCV2病毒，并將該方法同傳統(tǒng)的PCR方法和原位熒光雜交做了比較，結(jié)果所有37份陽(yáng)性樣品用巢式PCR和原位雜交均能全部檢出，而傳統(tǒng)的PCR方法只能檢出26份，該研究表明：巢式PCR方法和原位雜交均可用于PCV2感染的診斷和檢查。

3.1.4 競(jìng)爭(zhēng)PCR

競(jìng)爭(zhēng)定量PCR（c-PCR）是預(yù)先構(gòu)建一個(gè)具有與靶基因相同的擴(kuò)增效率和引物結(jié)合位點(diǎn)，但探針結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)標(biāo)的不同。在同一個(gè)反應(yīng)管中，靶基因和內(nèi)標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)性地與引物結(jié)合，進(jìn)行同步擴(kuò)增。因?yàn)槎呤歉?jìng)爭(zhēng)關(guān)系，所以當(dāng)一種模板量逐漸增加時(shí)，另一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)相對(duì)逐漸減少，但是兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的比值和兩種初始狀態(tài)時(shí)模板分子數(shù)的比值是一致的。所以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線可以進(jìn)行準(zhǔn)確核酸定量。該方法不僅具有PCR方法自身靈敏、特異、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，還具有簡(jiǎn)便和定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

崔尚金等[17]應(yīng)用PCR技術(shù)將PCV2 ORF2上490 bp片段P3P4基因擴(kuò)增后克隆到pMD 18-T載體以獲得目標(biāo)模板。然后構(gòu)建含692 bp的c-P3P4 DNA片段的競(jìng)爭(zhēng)模板，其攜帶與目標(biāo)DNA和靶DNA相同的引物結(jié)合區(qū)。以定量的競(jìng)爭(zhēng)模板同一系列稀釋的競(jìng)爭(zhēng)模板進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)PCR擴(kuò)增，以產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(IOD)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果當(dāng)反應(yīng)體系中起始模板的量為1.0×107cop/μL，循環(huán)次數(shù)小于或等于30時(shí)，原始模板數(shù)以指數(shù)增長(zhǎng)。由此確定目標(biāo)模板和競(jìng)爭(zhēng)模板的最適工作濃度并用該方法檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)的PCV2基因組的拷貝數(shù)和臨床樣品中的PCV2 DNA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臨床樣品中的PCV2 DNA含量達(dá)到一定程度(肺中1.0145×107copies/ mL，血中0.8×107copies/mL，淋巴中9.698×108copies/mL)，豬表現(xiàn)臨床癥狀，而病毒在感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制在80 h基因的拷貝數(shù)達(dá)到最高，這為今后的研究莫定了基礎(chǔ)。

3.2 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR (FQ-PCR)技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

Brunborg等[18]建立了以TaqMan為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR方法，用于血清、血漿及組織樣品中的PCV2的定量檢測(cè)。用該法測(cè)定動(dòng)物中的病毒載量，對(duì)鑒別健康豬和帶PCV2的病豬十分有用。張福良等[19]采用PCR方法克隆了PCV2 ORF2基因，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD-ORF2作為PCV2 FQ-PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，對(duì)該模板進(jìn)行了酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果顯示，此FQ-PCR具有特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性都很高，在-20 ℃條件下保存20 d都沒(méi)有顯著的變化。

3.3 實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR)技術(shù)是指用SYBR Green熒光染料或熒光探針通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，以此達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，且不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。該技術(shù)可對(duì)PCR定量，且和常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，目前已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測(cè)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

Mcintosh等[20]利用建立的Realtime PCR方法，在臨床血清、肝臟、腎臟、糞便、心肌層、腸系膜淋巴結(jié)組織中均能成功檢測(cè)出PCV2。Brunborg IM等[18]建立了以Taq Man為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR方法，用于血清、血漿及組織樣品中的PCV2的定量檢測(cè)。

3.4 PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）

這種方法是指在生物進(jìn)化過(guò)程中DNA堿基序列插入、缺失或者改變，從而導(dǎo)致限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，是以PCR快速有效的增微量的DNA利用限制性酶進(jìn)行多態(tài)性分析的一種方法。這種方法分2步：首先利用PCV1與PCV2的共同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后用一定的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳觀察片段差異，從而確定PCV的類(lèi)型為PCV1或PCV2。此方法充分考慮了引物序列在不同毒株間的保守性和酶切位點(diǎn)的特異性，此方法可對(duì)不同地區(qū)來(lái)源的毒株進(jìn)行檢測(cè)分型，對(duì)不同地區(qū)PCV的分子流行病學(xué)調(diào)查以及PCV2相關(guān)疾病的診斷與研究具有重要的意義。

王新等[21]借助RFLP方法對(duì)PK-15細(xì)胞、IBRS-2細(xì)胞以及疑似豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)的病料進(jìn)行了PCV檢測(cè)以及血清型的鑒定。

3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)基本原理是利用能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的2-3對(duì)引物和一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，在等溫條件(65 ℃左右)下能高效、快速、高特異性地?cái)U(kuò)增靶序列。

Chen等[22]利用Cap蛋白基因設(shè)計(jì)6對(duì)特異引物建立了PCV2LAMP檢測(cè)方法，整個(gè)反應(yīng)在64 ℃條件下1 h內(nèi)完成，其DNA檢測(cè)極限為5個(gè)拷貝；靈敏度是PCR的10倍，且與PCV1， PPV，PRV及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）無(wú)交叉反應(yīng)。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備、擴(kuò)增結(jié)果可以憑肉眼便能直接觀察等優(yōu)點(diǎn)，為臨床檢測(cè)PCV2提供了一種快速簡(jiǎn)便的新方法。

3.6 原位雜交實(shí)驗(yàn)（ISH）

根據(jù)所用探針的特異性不同，可將ISH方法分為3類(lèi)，包括同時(shí)檢測(cè)PCV但不能進(jìn)行分型的ISH；可對(duì)PCV1和PCV2進(jìn)行分型的ISH及檢測(cè)PCV2與PPV或PRRSV混合感染的ISH。

2002年，Kin J等[23]建立了檢測(cè)和區(qū)分PMWS患豬體內(nèi)的PCV1和PCV2的雙重標(biāo)記原位雜交技術(shù)。他們用地高辛標(biāo)記的PCV1探針，生物素標(biāo)記的PCV2探針，檢測(cè)了經(jīng)福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織，經(jīng)熒光鏡下檢查，2種雜交信號(hào)分別顯示紅色和暗橙色。同年，Sirinarumitr T等[24]用針對(duì)PRRSV的地高辛標(biāo)記的RNA探針和針對(duì)PCV的熒光標(biāo)記的RNA探針同時(shí)進(jìn)行原位雜交，表明該方法不僅可同時(shí)檢測(cè)2種病毒的感染，而且還可為確定這2種病毒是否共同感染了同一細(xì)胞提供了證據(jù)。

3.7 基因芯片檢測(cè)技術(shù)

基因芯片(DNA chip)檢測(cè)技術(shù)是指將許多特定的寡聚核苷酸或DNA片段(稱(chēng)為探針)固定在芯片的每個(gè)預(yù)先設(shè)置的區(qū)域內(nèi)，將待測(cè)樣本標(biāo)記后和芯片進(jìn)行雜交，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)再通過(guò)計(jì)算機(jī)分析來(lái)檢測(cè)對(duì)應(yīng)片段是否存在及存在量的多少，以用于疾病的臨床診斷和檢測(cè)等。是近年來(lái)分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)。

肖馳等[25]根據(jù)PCV2、PRRSV和豬瘟病毒（CSFV）的基因序列選取靶標(biāo)，制備相應(yīng)的探針并構(gòu)建DNA芯片，能同時(shí)檢測(cè)出PCV2、PRRSV和CSFV感染。該方法除了特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)外，還具有高通量、并行性和結(jié)果判讀客觀、準(zhǔn)確和信息化的特點(diǎn)。但該方法目前費(fèi)用較高，限制了其實(shí)際應(yīng)用。

3.8 核酸雜交檢測(cè)技術(shù)

核酸雜交是指核酸分子單鏈之間由互補(bǔ)的堿基順序，通過(guò)堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的雜交雙鏈。姜永厚等[26]應(yīng)用該技術(shù)建立了一種快速檢測(cè)及鑒定PCV基因型的方法。臨床檢測(cè)結(jié)果表明該技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定PCV的基因型，且其靈敏度較凝膠電泳高。因此該技術(shù)適用于PCV臨床檢測(cè)及分子流行病學(xué)調(diào)查。

目前PCV2及相關(guān)的疾病已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生和流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)PCV2的診斷方法進(jìn)行了大量的研究，到目前為止，雖然已經(jīng)建立了多種PCV2的診斷方法，取得了一定的研究進(jìn)展，但各種診斷方法都有其局限性，因此要根據(jù)試驗(yàn)的目的要求，并結(jié)合具備的條件選擇適宜的檢測(cè)方法對(duì)豬圓環(huán)病毒進(jìn)行檢測(cè)。所以進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)PCV2診斷方法的研究，實(shí)現(xiàn)診斷方法簡(jiǎn)便性、診斷試劑商品化是十分必要的，以便及時(shí)地檢測(cè)出隱性感染豬和對(duì)臨床發(fā)病豬進(jìn)行原發(fā)性病原的確定，及時(shí)對(duì)本病進(jìn)行綜合防治，以減少本病所造成的經(jīng)濟(jì)損失，從而保障我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

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2017-05-05)

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目資助(黔科合NY字[2014]3055號(hào))；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目資助(黔科合J字[2013]2110號(hào))。

龍冬梅(1990-)，女，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)的科研學(xué)習(xí)。

*通訊作者：湯德元(1964-)，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail:tdyuan@163.com