俞春英，沈曉霞，沈宇峰，孫 健

(浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

蛇足石杉的研究進(jìn)展

俞春英，沈曉霞*，沈宇峰，孫 健

(浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

對(duì)蛇足石杉的資源分布、生物學(xué)特性、化學(xué)成分、繁殖技術(shù)和栽培種植方面的研究成果進(jìn)行總結(jié)分析。

蛇足石杉； 石杉?jí)A甲； 繁殖

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb. ex Murray) Trev.)為石杉科石杉屬草本植物?！度珖胁菟巺R編》稱為千層塔，是蛇足石杉的藥材名，各地別名有蛇足草、金不換、千金榨等，畬藥名為石壁果果。蛇足石杉以干燥全草入藥，味苦、辛、微甘，性平，小毒，歸肺、大腸、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒、生肌止血、散瘀消腫等功效[1]。現(xiàn)代研究表明，蛇足石杉中含有的石杉?jí)A甲[2-3]是一種高效膽堿酯酶抑制劑[4]，具有治療重癥肌無力、中老年癡呆,以及提高記憶力、空間思維能力、結(jié)構(gòu)推理能力等方面的作用[5]。優(yōu)點(diǎn)為作用時(shí)間長，安全指數(shù)大，穩(wěn)定性好，不良反應(yīng)小等。目前的石杉?jí)A甲類藥物的生產(chǎn)，依然以野生蛇足石杉為原材料，在提取率為100% 的情況下，提取1 kg的石杉?jí)A甲，需消耗掉將近 10萬 kg的蛇足石杉。資源的短缺使得藥材價(jià)格暴漲，據(jù)統(tǒng)計(jì)，純天然石杉?jí)A甲提取物在國際市場(chǎng)上的交易價(jià)格已到達(dá)50萬美元·kg-1[6-7]。自然條件下，蛇足石杉植株矮小，生長十分緩慢，年生長量僅 2.0～3.0 cm[8]，難以滿足市場(chǎng)需求，因此保護(hù)野生蛇足石杉資源已是當(dāng)務(wù)之急?，F(xiàn)對(duì)近年來有關(guān)蛇足石杉的資源分布、生物學(xué)特性、化學(xué)成分、繁殖技術(shù)和栽培種植方面的研究成果進(jìn)行系統(tǒng)的綜述。

1 資源分布情況

1.1 概況

蛇足石杉生于海拔300～2 700 m的林蔭濕地下、灌叢下、路旁或溝谷石上。全國除西北地區(qū)部分省區(qū)、華北地區(qū)外均有分布。亞洲其他國家和地區(qū)如日本、朝鮮半島、東南亞、南亞、太平洋地區(qū)、俄羅斯、大洋洲、中美洲亦有[9]。

1.2 國內(nèi)分布情況

蛇足石杉是一種廣泛分布于林下的小型草本植物，受上層植物遮蓋，在野外環(huán)境中很難精確地確定數(shù)量和生物產(chǎn)量。為更好地反映國內(nèi)蛇足石杉資源狀況和天然生物量及可采量，吳葒等[10]在湖北(武當(dāng)山、高嵐)、湖南(張家界、衡山)、廣西(桂林、大瑤山)、廣東(大明山、鼎湖山、靈霄山)、貴州(梵凈山、白水)、云南(南澗、峨山、文山、昆明)、浙江(天臺(tái)、臨安、平陽、樂清、杭州)、江西(井岡山、廬山)、福建(武夷)、河南(信陽)、四川(都江堰、峨眉山)、重慶、藏南東喜馬拉雅山等12省、區(qū)展開了野外實(shí)地調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)蛇足石杉的分布地位于風(fēng)景區(qū)和自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，并初步確定我國蛇足石杉天然生物量為4 656.6 t，理論可采量為1 604 t，商業(yè)可采量不超過200 t。由此可見野生資源蘊(yùn)藏量及商業(yè)可采量已經(jīng)不能滿足日益增長的需求。

2 生物學(xué)特性

2.1 植物形態(tài)學(xué)

蛇足石杉是多年生蕨類植物[11]，株高10～30 cm，莖直立或下部平臥，具2叉分枝，頂端有時(shí)有芽胞，落地可生根成新苗，但在野外，生殖芽繁殖的現(xiàn)象極少。葉螺旋狀排列，具短柄，橢圓披針形，長1～2 cm，寬3～4 mm，基部楔形，邊緣有不規(guī)則的尖鋸齒，兩面光滑，有光澤，中脈突出明顯，薄革質(zhì)。

孢子葉與不育葉同行，孢子囊生于葉腋，腎形，黃色，孢子[9-11]成熟時(shí)裂開，為淡黃色粉末。孢子萌發(fā)后，形成配子體(原葉體)。成熟的配子體為不規(guī)則的塊狀體，貼于土表層，通過菌根汲取營養(yǎng)。配子體產(chǎn)生的精子和卵子在水的環(huán)境下受精，發(fā)育成胚，暫時(shí)寄生在配子體上，長大后配子體死亡，孢子體即獨(dú)立生活。整個(gè)生長周期長達(dá)8～10年。

2.2 顯微特征

中國植物志根據(jù)植物分類學(xué)將蛇足石杉劃分在蛇足石杉組，蛇足石杉組[9]中有皺邊石杉、昆明石杉、四川石杉、亮葉石杉等12種石杉屬植物，其中只有蛇足石杉是中藥材千層塔的基源，為確保藥材基源的準(zhǔn)確性，除了通過對(duì)植物形狀、大小等外觀鑒定外，還采用顯微技術(shù)進(jìn)行鑒定。

根據(jù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)[12]以及顯微特征發(fā)現(xiàn)蛇足石杉的根只具初生結(jié)構(gòu)，分為表皮、皮層和維管柱3個(gè)部分。分生區(qū)先端具有3個(gè)大型的薄壁細(xì)胞，起著支撐和保護(hù)作用，成熟區(qū)沒有根毛，被真菌代替，通過真菌吸收養(yǎng)分。莖中的薄壁組織是莖的主要組成部分，生物堿結(jié)晶位于內(nèi)外皮層間的薄壁細(xì)胞中，莖中的葉綠體位于近表皮的部分薄壁細(xì)胞中，說明莖也能進(jìn)行光合作用。葉由表皮、葉肉、葉脈組成。葉上下表皮均有氣孔分布，以下表皮居多，生物堿結(jié)晶位于上表皮細(xì)胞內(nèi)。葉肉細(xì)胞呈等徑形，內(nèi)含大量葉綠體，可進(jìn)行光合作用。生物堿主要存在于根的中柱木質(zhì)部和莖的皮層薄壁細(xì)胞中，少數(shù)存在于葉肉細(xì)胞及其胞間隙中，含量大小順序?yàn)槿~≈根>莖[13]。

關(guān)于蛇足石杉孢子的大小、形狀及表面紋飾，涂冬萍等[14]收集了廣東省6個(gè)縣的野生蛇足石杉資源，利用電鏡掃描，發(fā)現(xiàn)各居群的蛇足石杉孢子一般具有固定的輪廓及表面紋飾，孢子形態(tài)均為四面體型，輻射對(duì)稱，三裂縫，上被白色顆粒物，赤道面觀為近半圓或扇形，極面觀為鈍三角形，孔穴紋飾，有四分體痕。說明蛇足石杉的孢子受環(huán)境影響較小，但不同居群的孢子在極軸長、赤道軸長、極赤比、孔穴密集程度、裂縫形態(tài)及輻射區(qū)形態(tài)上有差異，這些可作為蛇足石杉資源多樣性的佐證。

3 生物堿成分研究及石杉?jí)A甲合成

3.1 生物堿成分

早在1881年，有學(xué)者已經(jīng)開始對(duì)蛇足石杉生物堿的研究，但直到1940年這方面的工作才得到廣泛的開展。1950年末到1960年初陸續(xù)揭示出其所含生物堿的結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)80年代，上海藥物研究所劉嘉森[15]從蛇足石杉中分離石杉?jí)A甲，化學(xué)名稱(5 R，9 R，11E)-5-氨基-11-亞乙基-5，8，9，10-四氫-7-甲基-5，9-亞甲基環(huán)辛四烯并(b)吡啶-2-(1 H)-酮)和石杉?jí)A乙。兩者都具有很強(qiáng)的抑制膽堿酯酶活性作用，特別是石杉?jí)A甲，引起了國內(nèi)外科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，目前從中分離鑒定的生物堿已達(dá)到90多種[16]。

近年來，蔣金和等[17]首次從云南屏邊產(chǎn)的蛇足石杉中通過溶劑提取、硅膠柱層析等方法分離鑒定出11個(gè)化合物，6個(gè)生物堿分別為石杉?jí)A甲、石杉?jí)A乙、石杉?jí)A庚、馬尾杉?jí)A乙、8β-羥基馬尾杉?jí)A乙、Iycoposerramine D，3個(gè)萜分別為serratenediol、21-episerratenediol、serratenediol-3-acetate和2個(gè)甾體分別為β-谷甾醇和胡蘿卜甙。鄭凱凱[18]等利用硅膠、反相硅膠、Sephadex HL-20等柱色譜進(jìn)行分離純化，通過磁核共振、質(zhì)譜等譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)，共分離得到11個(gè)化合物，10個(gè)為石杉型三萜類化合物，1個(gè)為二苯并呋喃醇類化合物，并發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新化合物—千層塔型香豆酸酯。

3.2 石杉?jí)A甲提取與合成

石杉?jí)A甲在蛇足石杉的含量僅為1/10萬，提高提取率及優(yōu)化化學(xué)合成石杉?jí)A甲都是有效的途徑。

石杉?jí)A甲的提取工藝較多應(yīng)用酸浸取、高效液相色譜、硅膠柱層析等分離法。以蛇足石杉為原料[19]，采用生物堿分離的傳統(tǒng)辦法，石杉?jí)A甲的提取率能達(dá)到79.4%以上。張衛(wèi)剛等[20]采用分析法對(duì)蛇足石杉中的石杉?jí)A甲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在乙醇濃度為90%，乙醇倍量7倍量，氨水調(diào)pH值9的條件下石杉?jí)A甲的提取率為89.26%。

通過構(gòu)建三碳橋環(huán)結(jié)構(gòu)是合成石杉?jí)A甲的關(guān)鍵[21]，近20年來石杉?jí)A甲的合成從最初階段的消旋化合成到手性合成，反應(yīng)步驟逐步減少，立體選擇性和總效率的不斷提高，都體現(xiàn)了合成領(lǐng)域的發(fā)展。但人工合成的石杉?jí)A甲均有一定的局限性[22-23]，原料化合物的多步合成，催化劑配體的定制合成，提高了合成成本；合成的石杉?jí)A甲中副產(chǎn)物較多，純度不夠；以及合成過程中產(chǎn)生的疊氮磷酸二苯酯，在工業(yè)化生產(chǎn)中存在危險(xiǎn)性等等。由于石杉?jí)A甲的生物活性極其有限的天然資源，國內(nèi)外藥物化學(xué)工作者對(duì)石杉?jí)A甲的合成，類似物及衍生物的合成，做了大量工作，至今僅有個(gè)別類似物能達(dá)到天然石杉?jí)A甲的活性[24]。

蛇足石杉植株內(nèi)含有豐富的內(nèi)生真菌，近年來，不少科學(xué)家嘗試從其內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中提取石杉?jí)A甲，韓文霞等[25]采集了四川的野生蛇足石杉，經(jīng)內(nèi)生真菌分離純化后再經(jīng)液體發(fā)酵，篩選出了尖鐮孢(鐮刀菌)，其發(fā)酵液中石杉?jí)A甲含量為11.1 mg·L-1，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到商業(yè)化生產(chǎn)的要求。

4 組織培養(yǎng)技術(shù)和扦插繁殖技術(shù)

4.1 組織培養(yǎng)技術(shù)

組織培養(yǎng)如以蛇足石杉的莖尖為外植體，采用不同濃度的次氯酸鈉溶液、升汞溶液，經(jīng)過多次滅菌，仍然很難解決莖尖污染問題。在刮去表皮的莖段的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源真菌[26]存在于莖段的皮層，至少在表皮組織內(nèi)。

為探討蛇足石杉中的內(nèi)生真菌含量是否會(huì)隨季節(jié)變化而變化，汪學(xué)軍等[27]分別采收8月、10月以及次年2月的蛇足石杉植株進(jìn)行內(nèi)生菌研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2月收集的蛇足石杉內(nèi)生真菌數(shù)量最少，為外植體的選擇提供了依據(jù)。劉江海等[28]以蛇足石杉活體莖尖為外植體，利用多種消毒劑進(jìn)行表面消毒以及用孔雀石綠、原子吸收光譜聯(lián)合殺滅內(nèi)生真菌，得到無菌苗二叉分枝，經(jīng)4次二叉分枝繼代培養(yǎng)后，得到數(shù)量不等的側(cè)芽，最多的植株可產(chǎn)生14個(gè)側(cè)芽，但側(cè)芽撥離、接種后死亡率較高。蛇足石杉莖尖誘導(dǎo)叢生芽和綠色小體的試驗(yàn)[29]中發(fā)現(xiàn)最為適宜的蔗糖濃度為2%和4%，平均每團(tuán)綠色小體可分化出16株叢生芽。

在自然條件下，蛇足石杉的繁殖方式主要是孢子繁殖和芽胞繁殖，但萌發(fā)較為困難。駱冰潔等[30]在蛇足石杉芽胞萌發(fā)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將芽胞接種于Moore培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)，溫度為(22±2)℃，芽胞的萌發(fā)率較高。韋景楓等[31]以孢子囊為外植體，在0.1%的氯化汞滅菌4～5 min，污染率高達(dá)93.5%，說明孢子囊內(nèi)部可能也存在豐富的內(nèi)生真菌。孢子在1/2 MS+GA35 mg·L-1的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在25～28 ℃，219 d后孢子萌發(fā)。包日雙[32]以孢子囊為外植體得到蛇足石杉的原葉體，原葉體在無激素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d后，增殖倍數(shù)達(dá)到131.1。培養(yǎng)90 d后，孢子體誘導(dǎo)率為4.0%，其中以11—12月采收的孢子萌發(fā)率較高。

4.2 扦插繁殖技術(shù)

蛇足石杉植物中內(nèi)生真菌的存在，給組織培養(yǎng)技術(shù)帶來了巨大的困難，扦插繁殖技術(shù)成為另一條大量繁殖蛇足石杉的途徑。選取5～8 cm的健壯頂芽插條，經(jīng)不同濃度的萘乙酸、吲哚丁酸、生根粉浸泡[33]，扦插于腐殖土與河沙的混合土壤的基質(zhì)中，其中以2 000 mg·L-1吲哚丁酸處理后的插條效果最好，2次觀察的發(fā)根率為90%～100%。龍華等[34]認(rèn)為，6 cm的插條在萘乙酸質(zhì)量濃度為20 mg·L-1中浸泡5 min,90 d后的成活率達(dá)到90%。覃大吉等[35]研制的蛇足石杉NFT扦插育苗技術(shù)中，以1 000 mg·L-1吲哚丁酸+1/8 MS無機(jī)營養(yǎng)液，98 d后，插條生根率達(dá)到98%。

5 栽培技術(shù)

解決人工培植技術(shù)難題的重要前提是充分了解蛇足石杉天然居群的生態(tài)因子及居群特點(diǎn)。從野生蛇足石杉分布來看，海拔分布相對(duì)較廣，從50 m到2 700 m的山地密林下或溝谷陰濕土均有分布。居群環(huán)境具空氣濕度大，年均降水量和郁閉度高等特點(diǎn)[9-10]。

根據(jù)蛇足石杉[36-37]自然群居結(jié)構(gòu)、原生境土壤養(yǎng)分、酸堿度及空氣溫濕度等的調(diào)查測(cè)定發(fā)現(xiàn)，自然群居結(jié)構(gòu)分為集中分布居群、分散分布居群2種。其中集中分布居群主要由幼苗和幼株構(gòu)成，占居群植株的80%左右，更新能力較強(qiáng)，但要注意植株間的距離，避免過密導(dǎo)致幼苗的死亡，減弱其更新能力。

pH值為4.75～5.31的偏酸性土壤有利于蛇足石杉集中分布居群的形成[38-39]，且蛇足石杉對(duì)K、Ca、Zn和Na的需要程度較高，對(duì)Pb、Cu、Cd 3種重金屬元素的富集能力較強(qiáng)，在人工栽培中應(yīng)注意協(xié)調(diào)各元素的合理配給，注意土壤酸堿度的調(diào)控。

適宜的溫度[40]是蛇足石杉生長發(fā)育的必要條件，過高或過低的溫度脅迫會(huì)抑制植物的整個(gè)發(fā)育過程。分別在25、30、35、40 ℃的溫度處理蛇足石杉，通過測(cè)定葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離脯氨酸含量及超氧化物歧化酶、過氧化物酶的活性，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，表明蛇足石杉適宜生長溫度在25～30 ℃，持續(xù)35 ℃對(duì)生長有明顯的影響，40 ℃為極限高溫，短期內(nèi)會(huì)引起死亡。王志安等[41]在浙江安吉的毛竹林下仿野生種植蛇足石杉，光照強(qiáng)度控制在1 330～3 000 lx[42]，相對(duì)濕度控制在80%以上，經(jīng)過2年的自然栽培，蛇足石杉生長情況良好，能夠正常萌芽，并能在新芽的葉腋內(nèi)產(chǎn)生孢子囊，在開裂后釋放孢子。

6 小結(jié)與展望

目前以石杉?jí)A甲為原料的哈伯因、雙益平等藥品已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，并已上市。需求的猛增，高利益的誘惑直接導(dǎo)致蛇足石杉野生資源被無節(jié)制地采挖，使野生蛇足石杉瀕臨滅絕。

人工合成石杉?jí)A甲不僅有利于緩解市場(chǎng)需求，還能有效的保護(hù)野生蛇足石杉資源。雖然人工合成石杉?jí)A甲技術(shù)已有一定的進(jìn)展，但目前人工合成的石杉?jí)A甲的乙酰膽堿酯酶抑制活性不強(qiáng)，無法與天然提取的石杉?jí)A甲相比。因此，優(yōu)化石杉?jí)A甲的提取工藝，提高石杉?jí)A甲的提取率，以及選育高含量的蛇足石杉品種，可作為今后的努力方向。通過提取內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可作為天然活性產(chǎn)物—石杉?jí)A甲的又一來源，但目前產(chǎn)生的石杉?jí)A甲較少。今后可通過優(yōu)化培養(yǎng)條件、加入刺激物、篩選高產(chǎn)突變菌株和基因工程等手段來提高石杉?jí)A甲產(chǎn)量。

蛇足石杉為低等蕨類植物，自然條件下蛇足石杉生長緩慢，繁殖能力弱，根據(jù)蛇足石杉的資源分布情況，天然的常綠闊葉林和季風(fēng)常綠闊葉林及其退化的次生生態(tài)系統(tǒng)，以及人工柳杉林或陰坡的人工杉木林、毛竹林都是蛇足石杉最適宜的種植地。研究及了解蛇足石杉天然居群的生態(tài)因子及居群特點(diǎn)(如溫度、濕度、光照)等因素，結(jié)合林下仿野生栽培技術(shù)，有利于保護(hù)稀缺中藥資源，促進(jìn)中藥資源的可持續(xù)利用。

近年來，利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，以蛇足石杉的莖尖、孢子、孢子囊等為外植體，均發(fā)現(xiàn)蛇足石杉中含有內(nèi)生真菌。以孢子囊為例，孢子囊中含有大量的內(nèi)生真菌，通過表面滅菌，并不能達(dá)到很好的效果，作者根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行試驗(yàn)，未能得到蛇足石杉的原葉體，可能是由于采收孢子囊的季節(jié)不同。作者認(rèn)為，篩選出一種適合內(nèi)生真菌和外植體共同生長的培養(yǎng)基可作為今后組培研究的方向；側(cè)芽剝離后，造成側(cè)芽死亡等問題也有待進(jìn)一步的深入研究。

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2017-10-11

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016C32044)

俞春英(1992—)，女，浙江杭州人，技術(shù)員，大專，研究方向?yàn)檗r(nóng)學(xué)，E-mail:kekedou_ing@163.com。

沈曉霞(1972—)，女，浙江海寧人，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)橛N，E-mail:xiaoxiashen@sina.com。

文獻(xiàn)著錄格式：俞春英，沈曉霞，沈宇峰，等. 蛇足石杉的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(12)：2179-2183.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171230

S567

A

0528-9017(2017)12-2179-05

張才德)