李福智 梁 帥 熊茂林 王宇彤 張克劍 侯 陽

(錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121001)

CIK細胞對LLC小鼠肺癌細胞株誘導凋亡的影響

李福智 梁 帥1熊茂林1王宇彤1張克劍2侯 陽3

(錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121001)

目的探討干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-2及CD3抗體誘導細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)對LLC小鼠肺癌細胞株存活率和凋亡相關因子14-3-3ζ及p-Bad蛋白表達的影響。方法常規(guī)CIK細胞的體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)CIK細胞為效應細胞，LLC小鼠肺癌細胞株為靶細胞，通過復合培養(yǎng)體系(Transwell培養(yǎng)板)將CIK細胞與LLC小鼠肺癌細胞株建立共培養(yǎng)體系。根據(jù)培養(yǎng)時間不同分3組(10、15、20 d)運用四甲基唑藍(MTT)比色法檢測LLC小鼠肺癌細胞的存活率。Western印跡檢測CIK細胞14-3-3ζ、p-Bad蛋白表達變化。結果光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，成功地誘導出CIK細胞。培養(yǎng)20 d時LLC肺癌細胞的存活率明顯低于10 d組和15 d組(Plt;0.01)。Western印跡檢測LLC小鼠肺癌細胞中14-3-3ζ、p-Bad的表達均有下調。結論隨著培養(yǎng)時間的延長CIK細胞對LLC小鼠肺癌細胞的存活率逐漸降低并能促進LLC小鼠肺癌細胞的凋亡。

CIK 細胞；LLC小鼠肺癌細胞株；14-3-3ζ；p-Bad

肺癌已經(jīng)成為各種癌癥中導致死亡的首要原因〔1〕。目前，我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9%〔1〕。目前各種腫瘤的免疫細胞治療非常活躍〔2～4〕，成為腫瘤生物治療中重要的發(fā)展方向。1991年美國斯坦福大學Sdmfidt-Wolf等首次報道了細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)。他們采用多種細胞因子，由非貼壁的單個核細胞誘導出具有高增殖能力和高細胞毒性的殺傷細胞〔5〕。14-3-3蛋白是一種高度保守的可溶性酸性蛋白家族，參與細胞周期、信號傳導、細胞凋亡及惡性轉化的調控〔6〕。14-3-3ζ可以通過不同機制對凋亡產(chǎn)生抑制效應，其中之一就是對Bcl-2家族的調控〔7〕。Bad是促凋亡因子，在腫瘤中的表達具有重要意義。本文旨在探討CIK細胞對LLC小鼠肺癌細胞株凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1材料 LLC小鼠肺癌細胞株(LLC)購自中國科學院細胞庫。屬上皮樣肺腺癌細胞。CIK細胞來源于健康人外周血單個核細胞(PBMC)，由錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院體檢中心提供。加樣器GILSON(法國)、生物顯微鏡Olympus(日本)、倒置顯微鏡Olympus(日本)、加濕CO2孵箱Thermo SCIENTICFIC(德國)、生物安全柜HEAL FORCE HFsafe-1200(上海)、主要試劑Transwell培養(yǎng)板Corning Incorporated(美國)、噻唑藍(MTT)Sigma公司、DMEM(培養(yǎng)基)GIBCO公司、胎牛血清(FBS)GIBCO公司、Percoll分離液華美生物工程公司、P-Bad兔多克隆抗體Santa cruz公司、14-3-3ζ、兔多克隆抗ASCAM公司、蛋白marker NEB公司、CD3單克隆抗體美國。

1.2方法 LLC小鼠肺癌細胞株的培養(yǎng)：在倒置顯微鏡下觀察整體細胞的生長情況，可見細胞貼壁生長，細胞狀態(tài)尚可。放置培養(yǎng)箱中靜置4～5 h，可進行傳代。棄去培養(yǎng)液以防止殘留培養(yǎng)液中的血清對胰蛋白酶的抑制作用，用磷酸鹽緩沖液(PBS，不含鈣、鎂離子)洗2次。加1 ml胰酶消化液置培養(yǎng)瓶中，倒放37℃培養(yǎng)箱或室溫25℃以上，消化1～4 min。之后翻轉培養(yǎng)瓶10～30 s后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況：見細胞大部分變圓、胞質回縮，細胞間隙增大。迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加完全培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基+10% FBS、100 μ/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素)終止消化。按5 ml/瓶補加入完全培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出一半，分到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。LLC小鼠肺癌細胞株的凍存方法：凍存液90% FBS，10%二甲基亞砜(DMSO)。梯度降溫：4℃，15～20 min；-20℃ 30～40 min。見細胞懸液結凍后，放入-80℃冰箱最后儲存于液氮中長期保存。

1.3CIK效應細胞的制備 CIK細胞的體外培養(yǎng)方法〔8〕：取健康者PBMC 30 ml,將其收集于裝有肝素瓶中，37℃室溫存放即可轉移至超凈臺上。用移液器轉移至裝有淋巴細胞分離液的離心管中，注意外周血需要放在淋巴細胞的上層。12 000 r/min離心15 min。用0.9%生理鹽水1∶1稀釋混勻，12 000 r/min離心15 min。取細胞層，生理鹽水在12 000 r/min漂洗10 min棄上清，再漂洗1次。離心和洗滌均完成后，棄上清再將其移至IMDM培養(yǎng)液中(含10%FBS)懸浮細胞，置175 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。第1天加入rh干擾素(rhIFN)-γ 1 000 U/ml，放置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2天加50 ng/ml的抗CD3單克隆抗體、300 U/ml的rhIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d半量換液，同時補加300 U/ml的白細胞介素(IL)-2，調細胞濃度至1×106個/ml。

1.4實驗分組 以CIK細胞為效應細胞，LLC小鼠肺癌細株為靶細胞，通過復合培養(yǎng)體系(Transwell培養(yǎng)板)將CIK細胞與LLC小鼠肺癌細胞建立培養(yǎng)體系。設立正常對照組和空白對照組。根據(jù)培養(yǎng)時間不同分3組(10 d、15 d、20 d)運用MTT比色法檢測LLC肺癌細胞的存活率，Western印跡檢測CIK細胞14-3-3ζ、p-Bad蛋白表達變化。

1.5MTT比色法檢測LLC小鼠肺癌細胞活力 測定共培養(yǎng)10、15、20 d LLC肺癌細胞活力。調整靶細胞LLC小鼠肺癌細胞濃度5×104/ml，加入96孔板內，200 μl/孔，24 h后換液。檢測前3 h換成相應的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)至3 d時進行檢測。每孔加入MTT溶液(5 mg/ml用PBS配制，pH7.4)10 μl，37℃繼續(xù)孵育3 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加100 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)，記錄結果。重復5次，取其均值，計算細胞存活率。

1.6Western印跡檢測LLC小鼠肺癌細胞中14-3-3ζ、p-Bad表達變化 收集在7 d的Lewis肺癌細胞(密度為2×106個/ml)，離心，PBS沖洗。加入細胞裂解液60～100 μl，短暫振蕩。冰上作用30 min，12 000 r/min離心5 min。棄上液，提取培養(yǎng)液中的蛋白質樣品，Bradford法測定濃度。在120 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中進行電泳分離后，電轉移法將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用轉膜液潤濕一張厚濾紙，鋪于半干轉印儀的底層電極板上。將PVDF膜鋪于濾紙上，勿留氣泡。將凝膠貼于PVDF膜上，不留氣泡。潤濕另一張厚濾紙，蓋在凝膠上面，用玻璃試管趕去氣泡。蓋上頂層電極板，接通正負極電源，15 V(不超過25 V)轉印20 min。配封閉液。取出PVDF膜，和膠相鄰面向上浸入封閉液置于搖床緩慢搖1 h以上。倒掉封閉液，洗膜液略洗一下。取15 ml離心管加入用5 ml雜交液，按適當比例稀釋一抗。PVDF膜在含有50 g/L脫脂奶粉的Tris鹽緩沖液(TTBS)中37 ℃封閉90 min，依次加入一抗(抗人CD3、 CD56單克隆抗體，抗體稀釋濃度為1∶1 000)，4℃孵育過夜。取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5 min。倒掉TBST，把PVDF膜放入裝有二抗(辣根過氧化酶標記的羊抗人IgG，抗體稀釋濃度為1∶1 000)37℃作用40 min。TTBS充分漂洗(10 min×3次)后，化學熒光法(BCIP/NBT混合液)顯色，觀察結果，進行凝膠圖像分析。

1.7統(tǒng)計學方法 應用SSPSS17.0軟件進行單因素方差分析、q檢驗。

2 結 果

2.1LLC小鼠肺癌細胞在光鏡下觀察 細胞貼壁生長，細胞已完全伸展，細胞形態(tài)呈梭形或類似成纖維狀。CIK細胞在剛培養(yǎng)時細胞呈懸浮生長，大小均一，折光性強。5 d時可見細胞體積增大，部分細胞出現(xiàn)集落生長。12 d時細胞數(shù)量開始增多，光鏡下可見胞核增大，胞質增多。

2.2MTT比色法檢測共培養(yǎng)后LLC小鼠肺癌細胞存活率 培養(yǎng)20 d時LLC小鼠肺癌細胞的存活率〔(60.32±1.02)%〕明顯低于10 d〔(79.23±1.22)%〕、15 d〔(69.45±1.34)%〕、空白對照組〔(95.52±0.22)%〕和正常對照組〔(100.00±0.00)%〕。結果培養(yǎng)不同時間(10 d、15 d、20 d)LLC小鼠肺癌細胞組與空白對照組和正常對照組，差異均有顯著性(Plt;0.01)。

2.3Western印跡檢測14-3-3ζ、p-Bad蛋白的表達 取10 d組，15 d組、20 d組不同培養(yǎng)時間的LLC小鼠肺癌細胞，進行Western印跡檢測LLC小鼠肺癌細胞中14-3-3ζ、p-Bad蛋白含量的變化，β-actin為內對照。結果顯示LLC小鼠肺癌細胞中14-3-3ζ、p-Bad的表達均降低。

3 討 論

肺癌是起源于支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤，臨床上常分為非小細胞肺癌及小細胞癌兩大類，其中非小細胞肺癌約占75%。近年來肺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，現(xiàn)已為我國男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。肺癌的發(fā)病年齡大多在40歲以上，男性居多，但女性肺癌的發(fā)病率近年來明顯增加。早期肺癌通過手術等綜合治療，治愈率可以達到50%以上，但是仍然面臨復發(fā)、轉移等棘手問題。因此肺癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，以及術后復發(fā)、轉移的盡早發(fā)現(xiàn)與治療,是肺癌獲得根治的關鍵和難點之一。CIK細胞選擇性地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有毒性。CIK細胞殺瘤譜廣、殺瘤效率高、對化療耐藥腫瘤同樣敏感。同時具有免疫殺傷活性強且持久。

本研究結果提示，CIK細胞能夠降低體外培養(yǎng)LLC小鼠肺癌細胞的存活率，CIK細胞可分泌大量的Th1類細胞因子〔9〕。CIK細胞作為最終的效應細胞，可以通過MHC非限制性途徑〔10〕發(fā)揮對腫瘤細胞的直接殺傷作用，而對正常細胞沒有影響。CIK細胞是誘導、激活的自體細胞，在共培養(yǎng)的過程中CIK細胞可致DC高表達特異性的抗原提成分子，促進DC大量分泌IL-12等細胞因子，進而增強CIK細胞的細胞毒性，并能成功誘導Th1型免疫應答，達到清除腫瘤細胞的目的。CIK細胞具有獨特的功能，可以選擇性地殺傷腫瘤細胞，殺瘤效率高且對正常細胞沒有毒性，即使對化療耐藥的腫瘤也同樣敏感。

CIK細胞共同表達了CD3和CD56兩種膜蛋白分子,是目前所知殺傷活性最強的一種腫瘤生物治療效應細胞〔4〕,研究認為CIK細胞對腫瘤的殺傷作用是通過釋放顆粒酶、穿孔素而裂解靶細胞,對靶細胞的裂解是CIK細胞殺傷靶細胞的主要機制,也有學者認為進入體內活化的CIK細胞可分泌多種細胞因子如干擾素γ、腫瘤壞死因子和IL-2等,不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用,而且還可通過調節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷瘤細〔5,6〕。

凋亡受到抑制，才導致細胞出現(xiàn)異常增殖而發(fā)展為腫瘤細胞。14-3-3蛋白家族可以和許多信號蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受體等結合，在信號傳導、細胞周期及細胞凋亡的調控等方面發(fā)揮重要作用。14-3-3ζ是該家族中的一個亞型，其確切功能還不完全明了，目前對14-3-3ζ的研究主要集中在它對凋亡的調控上。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中存在14-3-3ζ的高表達，且降低14-3-3ζ的表達可使體外實驗的癌細胞活性減弱。本實驗表明DC-CIK細胞可以降低體外培養(yǎng)Lewis肺癌細胞中14-3-3ζ蛋白的表達。Bad在許多人類正常組織中都有表達，在睪丸、乳腺、結腸和脾內有較高水平的穩(wěn)定表達。Bad在生存期較長的位于基底膜的基底細胞表達密度較低，而在向表面遷移的分化細胞中密度較高，表明Bad在分化細胞中有促凋亡作用。另外Bad是多種刺激引起激酶的普遍靶點，這些外界刺激包括生長因子、細胞因子、可誘導細胞內鈣升高的藥物和介導腺苷酸環(huán)化酶的神經(jīng)遞質等。14-3-3ζ蛋白在細胞凋亡過程中的具體作用及其機制目前尚無定論，但有學者研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3ζ可以競爭性地與p-Bad結合，導致p-Bad喪失了與Bcl-XL和Bcl-2結合的機會，進而啟動一系列下游反應并最終抑制了細胞凋亡的發(fā)生。因此認為，DC-CIK細胞可能是通過上述機制降低了14-3-3ζ和p-Bad蛋白的表達，促進了體外培養(yǎng)Lewis肺癌細胞的凋亡，進而阻止了癌細胞的無限增殖。

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〔2017-04-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

R734.2

A

1005-9202(2017)22-5549-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.027

遼寧省教育廳2016年省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(20161060044)

1 錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 2 吉林省腫瘤醫(yī)院胸外一科

3 錦州醫(yī)科大學生命科學研究院

侯 陽(1982-)，女，講師，主要從事腫瘤免疫研究。

李福智(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的發(fā)病機制與轉移研究。