牛江濤，曹 瑞，張澤國，徐富菊，李越峰，3#（1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標準研究重點實驗室，蘭州 730000；3.隴南市武都區(qū)政府，甘肅隴南 746000）

紅芪多糖的提取分離及藥理作用研究進展Δ

牛江濤1，2＊，曹 瑞1，2，張澤國1，2，徐富菊1，2，李越峰1，2，3#（1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標準研究重點實驗室，蘭州 730000；3.隴南市武都區(qū)政府，甘肅隴南 746000）

目的：為紅芪多糖的深入研究及進一步開發(fā)利用提供參考。方法：以“紅芪多糖”“提取分離”“藥理作用”“HPS”“Radix hedysari polysaccharide”“Hedysarum polybotys saccharide”等為關鍵詞，組合查詢2005年1月－2016年6月在PubMed、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關文獻，對紅芪多糖的提取分離、含量測定方法、抗氧化活性及其藥理作用進行綜述。結(jié)果：共檢索到相關文獻161篇，其中有效文獻46篇。目前，紅芪多糖的提取仍以傳統(tǒng)水提醇沉為主，多由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成。紅芪多糖的含量測定方法以苯酚-硫酸比色法為主，除此之外還有高效液相色譜法。研究表明，紅芪多糖具有抗氧化活性和抗腫瘤、抗癌、提高機體免疫力、抗糖尿病等多種藥理作用。結(jié)論：紅芪多糖的提取分離、含量測定方法及其藥理活性研究已取得了一定進展，但目前仍停留在實驗研究階段，未來應進一步加強其工業(yè)化提取和制劑生產(chǎn)的相關研究。

紅芪多糖；提取；分離；含量測定；藥理作用

紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根。主產(chǎn)于甘肅隴南、武威、隴西等地區(qū)，是甘肅道地藥材之一，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效[1-2]。隨著20世紀80年代日本學者從紅芪中分離出黃芪中不存在的抗菌成分1-3-羥基-9-甲氧基紫檀烷后，紅芪的研究逐漸引起了國內(nèi)學者的廣泛關注。紅芪多糖（HPS）是紅芪的主要活性成分之一，是一種雜多糖[3-5]。研究表明，HPS具有抗氧化活性和抗腫瘤、抗癌、提高免疫力、治療糖尿病等多種藥理作用[6-9]，故其開發(fā)利用價值正日益受到關注。筆者以“紅芪多糖”“提取分離”“藥理作用”“HPS”“Radix hedysari polysaccharide”“Hedysarum polybotys saccharide”等為關鍵詞，組合查詢2005年1月－2016年6月在PubMed、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關文獻。結(jié)果，共檢索到相關文獻161篇，其中有效文獻46篇?，F(xiàn)就HPS的提取分離、含量測定方法、抗氧化活性和其藥理作用進行綜述，以期為HPS的深入研究及進一步開發(fā)利用提供參考。

1 HPS的提取分離及含量測定方法

1.1 HPS的提取方法

多糖根據(jù)其性質(zhì)特點，常用的提取方法主要有水提取法、堿提取法、酸提取法等化學方法，還有超聲提取法、微波提取法等物理提取方法，以及酶法等生物學方法。而HPS的提取方法由文獻報道可知主要有傳統(tǒng)的水提醇沉法、酶法提取法和超聲提取法等。

1.1.1 水提醇沉法 水提醇沉法是HPS的傳統(tǒng)提取方法，也是目前應用最廣泛的HPS提取方法。馬丹[10]采用正交試驗設計，以乙醇浸泡時間、乙醇回流時間、藥材量與濃縮液體積比為因素，以70%醇沉HPS在粗品中的含量為指標，得到紅芪粗多糖的最優(yōu)提取工藝為藥材用乙醇浸泡12 h后再以乙醇回流1 h，藥材量與濃縮液體積比為1∶2。在此基礎上又采用正交試驗，以溫浸溫度、溫浸時間、溫浸次數(shù)為因素，得到紅芪粗多糖的最優(yōu)水提醇沉工藝為溫度60℃、時間1 h、提取2次。袁菊麗等[11]以加水量、溫浸時間、溫浸溫度、提取次數(shù)為正交試驗因素，以HPS的得率和提取物的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為指標，經(jīng)綜合評價，得到優(yōu)選HPS水提醇沉工藝為提取溫度70℃、15倍量水提取2次、每次3 h、醇沉濃度70%，結(jié)果HPS得率可達5.41%，DPPH自由基清除率可達0.83%。

1.1.2 微波輔助提取法 除傳統(tǒng)水提法外，劉寶劍等[12]還采用微波-超聲波法對HPS進行了提取，并與常規(guī)提取法進行了比較。結(jié)果表明，兩種提取方法得到的多糖含量差別較大，常規(guī)法得多糖含量為4.19%，微波-超聲波法得多糖含量為8.98%。趙保堂等[13]采用微波輔助法提取HPS，并利用響應面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取參數(shù)為提取時間45 min、微波作用功率213 W、溫度80℃、液料比26∶1、提取1次。在此條件下，HPS的得率可達10.11%左右。

1.1.3 酶解法 譚玉玲[14]以酶用量、酶解溫度、酶解時間作為正交考察因素，確定出HPS纖維素酶法浸提的最優(yōu)工藝條件為酶用量0.3%、酶解溫度40℃、酶解時間110 min。魏舒暢等[15]在均勻設計及單因素試驗的基礎上，以生物酶用量、酶解時間、提取時間和加水倍量為試驗因素，以紅芪總多糖、總皂苷提取率為指標，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設計對紅芪酶解提取工藝進行優(yōu)化，得到紅芪酶解的最佳提取工藝為酶用量280 mg、酶解時間90 min、加水量21倍、提取時間180 min。酶解法屬于生物提取法，有很高的專屬性，具有用量少、化學污染小等特點，具有較大的發(fā)展前景。

目前，水提醇沉法依然是HPS提取的最常用方法，但由于水作為溶劑難以完全溶出紅芪中的多糖物質(zhì)，所以需要多次浸提，操作時間長。相較而言，酶提法和超聲提取法因其操作簡單、提取工藝條件溫和、提取時間短、提取率高等優(yōu)點而具有廣闊的應用前景。而且HPS提取工藝的評價應該向多指標綜合性方向發(fā)展，不能僅僅局限于單一的多糖得率。

1.2 HPS的分離方法與成分分析

目前有關HPS的分離方法的研究報道較少。馬丹[10]用分步醇沉法，得到的多糖1、2、3通過凝膠柱色譜后證明均可再分為兩部分；采用氣相色譜法測定發(fā)現(xiàn)這3種多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成。楊濤[16]通過水提、30%乙醇沉淀從紅芪中得到了紅芪多糖1（HPS1），并進一步分離純化得到4個均一組分。陳同強等[4]對紅芪多糖3（HPS3）進行了一系列分離純化后得到4個均一組分HPS3-A、HPS3-B、HPS3-C、HPS3-D，并經(jīng)薄層色譜法與氣相色譜法分析得出，HPS3-A主要由葡萄糖組成，而HPS3-B、HPS3-C、HPS3-D主要由阿拉伯糖與半乳糖組成?；莺推降萚5]報道，紅芪粗多糖采用三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白，再經(jīng)Sephadex G-25柱層析分離純化得均一組分紅芪多糖2（HPS2）。HPS是一種雜多糖，不同單糖種類和數(shù)目組成了不同的HPS結(jié)構，目前其分離研究正逐步深入。

1.3 HPS的含量測定方法

目前，HPS的含量測定主要采用苯酚-硫酸比色法。該方法的原理是多糖在硫酸作用下，迅速分解產(chǎn)生單糖，并隨即脫水生成糖醛衍生物，從而可用比色法測定其含量。研究表明，該法簡便靈敏、準確可靠、重現(xiàn)性好[17-18]。魏舒暢等[19]采用改良差示酚硫法，建立直接以葡萄糖為對照品的紅芪粗多糖的定量測定方法。歐陽亦華等[20]采用蒽酮-硫酸分光光度法對HPS含量進行了測定，也得到較好的結(jié)果。李冰等[21]采用高效液相色譜（HPLC）法、蒸發(fā)光散射檢測器測定HPS的含量。在測定前，先將HPS通過一系列分離純化技術得到葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖等單一組分后再用HPLC法進行測定。苯酚-硫酸比色法雖然是測定HPS的最常用方法，但此法只能測定總多糖含量而無法測定多糖中的單一成分，而且應用該法測定HPS時還需測定轉(zhuǎn)換因子（f）值，因而增加了試驗誤差，影響了實驗效率。而采用HPLC法測定HPS，不僅能夠測定多糖中的單一組分，而且也避免了計算f值，結(jié)果更加準確。但因其樣品前期處理煩瑣且不能測定總多糖，所以也具有一定的限制性。因此，探索研究更加高效、準確的HPS測定方法，具有很大的實用意義。

2 HPS的抗氧化活性

楊杰等[22]研究表明，HPS對氧化低密度脂蛋白誘導的人腦微血管內(nèi)皮細胞氧化損傷模型具有明顯保護作用，其機制與清除自由基、抗氧化應激等密切相關。楊小虎[23]研究發(fā)現(xiàn)，HPS在0.25～8 mg/mL范圍內(nèi)對羥自由基的清除作用與質(zhì)量濃度呈正相關，半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.81 mg/mL；在1～20 mg/mL范圍內(nèi)對超氧陰離子自由基的清除作用與質(zhì)量濃度也呈正相關，其IC50為15.49 mg/mL。而HPS對小鼠肝組織勻漿的自發(fā)性脂質(zhì)過氧化保護作用較L-抗壞血酸強。灌服HPS粗品，能夠明顯緩解環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠肝、腎中丙二醛（MDA）含量上升、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性下降，提高小鼠的抗氧化能力?？軐幍萚6]研究表明，HPS具有較強的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的作用。雷豐豐等[24]研究發(fā)現(xiàn)，紅芪總多糖可清除大鼠體內(nèi)超氧陰離子自由基和羥自由基，其清除率與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并可降低肝組織和血清中MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性（P＜0.05）。上述研究表明，HPS具有較強的體內(nèi)外抗氧化活性。

3 HPS的藥理作用

3.1 抗腫瘤與抗癌作用

劉忠[25]研究表明，HPS對體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細胞生長具有抑制作用，其抑制機制可能是通過阻止細胞周期的進程而誘導腫瘤細胞凋亡。HPS1和HPS3分別是HPS對人肝癌HepG2細胞、人胃癌MGC-830細胞起抑制作用的關鍵活性組分，各分離組分的抗腫瘤活性與其分子質(zhì)量大小和單糖構成有關。HPS還可通過調(diào)控Bcl-2基因（即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因）和Bax（即Bcl-2相關X蛋白）的表達，從而抑制人肺腺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞的生長增殖、阻滯G2/M期、誘導細胞凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[26-28]。王希玉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HPS可提高荷瘤小鼠生存質(zhì)量，抑制腫瘤生長。衛(wèi)東鋒[29]實驗結(jié)果表明，HPS可分別使小鼠胸腺細胞、人宮頸癌HeLa細胞和人肺腺癌A549細胞雙向凝膠電泳圖譜中69個蛋白點、21個蛋白點和35個蛋白點發(fā)生明顯變化；HPS聯(lián)合環(huán)磷酰胺可明顯抑制S180荷瘤小鼠瘤組織的生長，具有一定的協(xié)同增效作用；HPS可明顯提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾指數(shù)，減輕胸腺細胞的損傷，并可增強其腹腔巨噬細胞的吞噬能力。李菲等[8]進一步研究了HPS對人肺腺癌A549細胞蛋白表達圖譜影響，并提出雙向凝膠電泳圖譜中35個差異蛋白點可能是HPS抑制人肺腺癌A549細胞增殖與凋亡的關鍵調(diào)控蛋白質(zhì)。田河等[30]研究發(fā)現(xiàn)，HPS對膀胱癌大鼠的腫瘤生長確實有一定的抑制作用，其機制為增強機體免疫功能，同時其可能通過調(diào)節(jié)膀胱癌組織水通道蛋白1和水通道蛋白3，而產(chǎn)生利水滲濕功效，從而達到抗膀胱癌的效果?？梢?，HPS具有較強的抗腫瘤與抗癌活性，是開發(fā)抗腫瘤與抗癌藥物的潛在物質(zhì)基礎。

3.2 提高機體免疫力作用

王希玉、秦亮等[7，31]研究發(fā)現(xiàn)，HPS對小鼠體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率有明顯的促進作用，能增加不同月齡小鼠的胸腺和脾質(zhì)量，減輕免疫抑制小鼠胸腺細胞的損傷，提高小鼠的脾指數(shù)，且具有劑量依賴性。韋艷霞、李磊強等[32-33]報道，HPS3能顯著增加小鼠胸腺、脾指數(shù)，并能促進脾淋巴細胞增殖，顯著影響脾淋巴細胞蛋白質(zhì)表達。楊濤等[34]對HPS1及從HPS1中分離出的4個組分HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D的抗補體活性研究發(fā)現(xiàn)，HPS1-D、HPS1-A、HPS1-B抗補體活性較好，HPS1次之，HPS1-C的活性較弱；進一步研究發(fā)現(xiàn)，HPS1-D有一定程度的抗補體活性并呈一定的量-效關系。上述研究也印證了HPS是紅芪補中益氣功效的物質(zhì)基礎，同時表明HPS具有較強的提高機體免疫力的活性，在增強免疫力方面，具有較大的新藥研發(fā)前景。

3.3 抗糖尿病作用

金智生、周強等[35-36]研究表明，HPS可降低2型糖尿病大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、血糖及C肽（CP）水平，減輕胰島素抵抗（IR）并提高胰島素的敏感指數(shù)（ISI），并能增強胰島素的敏感性，在改善胰島素抵抗方面，具有同二甲雙胍相似的療效。趙良功等[9]實驗結(jié)果表明，HPS 3能顯著改善糖尿病小鼠全身癥狀、降低血糖水平并提高糖耐量。鄭海生等[37]研究發(fā)現(xiàn)，HPS能調(diào)節(jié)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的血脂紊亂，降低血清總膽固醇和三酰甘油，提高高密度脂蛋白的含量，提高了ISI。王麗娟等[38]研究發(fā)現(xiàn)，HPS對正常小鼠血糖水平?jīng)]有影響，但能顯著降低四氧嘧啶模型小鼠血糖水平，以及正常小鼠和四氧嘧啶模型小鼠糖耐量實驗中的血糖水平，并提出其降糖機制可能與改善機體對胰島素的敏感性有關。上述實驗研究結(jié)果表明，HPS能夠改善實驗小鼠糖尿病癥狀，緩解IR，具有一定的降糖作用。

3.4 其他作用

金智生等[39]研究指出，HPS可通過調(diào)節(jié)db/db小鼠腎組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和色素上皮細胞衍生因子（PEDF）蛋白表達，從而抑制腎臟血管增生，延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的進展，起到保護糖尿病腎病小鼠腎臟的作用。魏玉嬌、祁雪艷等[40-42]研究發(fā)現(xiàn)，HPS具有治療db/db小鼠2型糖尿病腎病的作用，其治療作用不依賴于降血糖，可能是通過抑制蛋白激酶Cα及其下游因子VEGF的過度表達，并抑制db/db小鼠腎小球系膜細胞上蛋白激酶C和P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）蛋白及mRNA的表達，增強金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP-1）mRNA的表達，進而減緩糖尿病腎病的病程進展。贠潔等[43]通過低溫強迫游泳并腰背部皮下注射3%角叉菜膠溶液，造成氣虛血瘀模型小鼠；用HPS灌胃，每天1次，連續(xù)5 d后發(fā)現(xiàn)，HPS能明顯延長小鼠的游泳時間（P＜0.05），縮短小鼠尾部血栓長度及降低其百分率（P＜0.05），并能明顯延長凝血時間（P＜0.01）。邵宏奎等[44]研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的HPS能夠促進體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞增殖，并抑制脂多糖作用的人牙周膜細胞分泌白細胞介素-1β、白細胞介素-6。另有研究表明，HPS對四氯化碳造成的小鼠肝纖維化具有明顯改善作用，對肝纖維化引起的骨丟失也有顯著改善[45]。此外，HPS對高糖誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，也具有保護作用[46]。

4 結(jié)語

HPS的提取目前主要采用水提醇沉法，但酶提法和超聲提取法等新的提取方法也在快速發(fā)展，且已發(fā)現(xiàn)其具有提高HPS提取率的優(yōu)勢。目前評價提取工藝的指標過于單一，在以后的提取工藝優(yōu)選時，應采取多指標綜合評價。HPS的分離純化研究依然較少，其含量測定目前主要采用苯酚-硫酸比色法，但該法存在不足之處，

需進一步改進。目前對其抗氧化活性和藥理作用相應機制的研究，已初步取得了一定進展，但仍停留在實驗研究階段，而且HPS的相關制劑開發(fā)滯后，未來應進一步加強工業(yè)化提取和制劑生產(chǎn)的相關研究。

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R979.5

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1001-0408（2017）01-0130-04

2016-05-04

2016-09-07）

（編輯：余慶華）

國家自然科學基金資助項目（No.81460611）；國家教育部科學技術研究重點基金資助項目（No.212186）；甘肅省自然科學基金資助項目（No.1010RJZA212；145RJZA076）；甘肅省財政廳高等學?；究蒲袠I(yè)務費專項基金資助項目（No.2013-2）；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題（No.GZK-2015-57）；蘭州市科技局項目（No.2014-1-188）

＊碩士研究生。研究方向：中藥及復方加工炮制機制及活性成分。E-mail：1090459314@qq.com

#通信作者：教授，博士后，碩士生導師。研究方向：中藥及復方加工炮制機制及活性成分。電話：0931-8765585。E-mail：lyfyxk@ 126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.34