張 閣，彭 永，劉國(guó)權(quán)，蔣 卉，馮 宇，朱良全*，丁家波*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察，北京 100081；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.02

多重PCR對(duì)禽分枝桿菌亞種鑒定的初步應(yīng)用

張 閣1，彭 永1，劉國(guó)權(quán)1，蔣 卉1，馮 宇2，朱良全1*，丁家波1*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察，北京 100081；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018)

為建立禽分枝桿菌多重PCR鑒定方法，根據(jù)國(guó)外報(bào)道的診斷方法設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，選用我國(guó)禽結(jié)核參考菌株(CVCC 68201)基因組DNA為模板，優(yōu)化了退火溫度，測(cè)定了DNA最小檢測(cè)量，并進(jìn)行了特異性檢驗(yàn)。采用優(yōu)化好的多重PCR體系，對(duì)國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心保存的禽分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)和分類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，禽結(jié)核參考菌株(CVCC 68201)能很好的擴(kuò)增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)三條目的條帶，基因組DNA的最小檢測(cè)量為0.38 ng/μL，目的條帶在退火溫度50 ℃～62 ℃之間均能得到有效擴(kuò)增。對(duì)23株禽分枝桿菌菌株檢測(cè)，并設(shè)立牛分枝桿菌作為陰性對(duì)照，最終將禽分枝桿菌菌株分為三大類：禽亞種/森林土壤亞種、副結(jié)核亞種、人豬亞種，與國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心的分類結(jié)果相比不僅一致且更加詳盡而有臨床意義。因此，基于分子生物學(xué)方法建立的多重PCR方法可以對(duì)禽分枝桿菌亞型進(jìn)行快速鑒定并對(duì)禽結(jié)核病的診斷提供參考。

禽分枝桿菌；亞型鑒定；多重PCR

禽分枝桿菌(Mycobacteriumavium)是一種環(huán)境分枝桿菌，在自然界中普遍存在，可從自然來(lái)源的水、土壤、植物、墊料中分離得到[1-2]。禽分枝桿菌能夠感染多種禽群，引起以腸道、肝臟和脾臟結(jié)核性結(jié)節(jié)為特征的病變，也可以感染人、豬、牛、羊等動(dòng)物[3-5]。禽分枝桿菌具體可分為4個(gè)亞種，即引起禽結(jié)核病的禽分枝桿菌禽亞種(M.aviumsubsp.avium,MAA)；從環(huán)境、人及豬分離出的禽分枝桿菌人豬型亞種(M.aviumsubsp.hominissuis,MAH)；引起牛羊等反芻動(dòng)物副結(jié)核病的禽分枝桿菌副結(jié)核亞種(M.aviumsubsp.paratuberculosis,MAP)；可導(dǎo)致林鴿禽結(jié)核病的禽分枝桿菌森林土壤亞種(M.aviumsubsp.silvaticum,MAS)[6-7]。準(zhǔn)確的亞種鑒定對(duì)禽結(jié)核病的診斷和防控具有重要意義，傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法不僅耗時(shí)、存在安全隱患，而且只能簡(jiǎn)單的將禽分枝桿菌復(fù)合體(M.aviumcomplex,MAC)分為禽分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌兩大類[5]。許多基于分子生物學(xué)的方法可用于禽分枝桿菌種型的鑒定，目前常用的禽分枝桿菌分型方法主要包括：16S rRNA測(cè)序法[8]、16S-23S rRNA間隔區(qū)測(cè)序法[9]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFLP)[10]等，但都存在耗時(shí)、判讀結(jié)果繁瑣等缺點(diǎn)。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)dnaJ基因是禽分枝桿菌4個(gè)亞種中均含有的片段，IS900基因是禽分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)特有的片段，通過(guò)檢測(cè)IS901基因、IS1245基因和dnaJ基因可確定禽分枝桿菌禽亞種(MAA)/禽分枝桿菌森林土壤亞種(MAS)的存在，通過(guò)檢測(cè)IS1245基因和dnaJ基因可確定禽分枝桿菌人豬亞種(MAH)的存在[11-12]。2008年，Moravkova等[13]建立了多重PCR方法并用于禽分枝桿菌亞型鑒定的研究。鑒于該方法在我國(guó)尚未有相關(guān)報(bào)道，為了加快推進(jìn)我國(guó)禽分枝桿菌流行病學(xué)研究并為禽結(jié)核病快速診斷奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)外最新的多重PCR方法對(duì)中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存的禽分枝桿菌進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌種及來(lái)源 試驗(yàn)中涉及到的28個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株均來(lái)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，見(jiàn)表1。

1.2 試劑、培養(yǎng)基和引物 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；一般PCR用Premix Taq購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；佩氏培養(yǎng)基(Petragnani medium)按照《獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)制備[15]。按照表2所示序列[13]，設(shè)計(jì)的PCR引物由中美泰和生物公司合成。

1.3 菌種復(fù)蘇、繁殖及基因組提取 無(wú)菌開(kāi)啟購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心各凍干菌株，分別使用1 mL滅菌生理鹽水將菌種溶解，接種到預(yù)先制備好的佩氏培養(yǎng)基斜面。置37 ℃培養(yǎng)2～4周，經(jīng)肉眼觀察長(zhǎng)出干燥顆粒狀乳酪色菌落后，用生理鹽水洗下用于提取基因組DNA。

1.4 禽分枝桿菌各亞種的多重PCR 建立

1.4.1 退火溫度的優(yōu)化 以提取的禽結(jié)核分枝桿菌參考菌株(CVCC 68201)全基因組DNA為模板，以參考文獻(xiàn)[13]設(shè)計(jì)的dnaJ、IS900、IS1245和IS901的4對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，將退火溫度設(shè)計(jì)成不同溫度梯度。反應(yīng)體系為20 μL：基因組1 μL，dnaJ引物(20 pmol/μL)、IS1245引物(10 pmol/μL)、IS900(10 pmol/μL)和IS901(10 pmol/μL)的上下游引物各1 μL，2×PCR反應(yīng)液Premix Taq 10 μL，滅菌雙蒸水1 μL。反應(yīng)程序：第一步，96 ℃ 2 min；第二步，96 ℃ 10 s，50 ℃(52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃和62 ℃) 10 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；第三步，72 ℃ 2 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.4.2 多重PCR靈敏度(基因組DNA最小檢測(cè)量)的確定 將1.4.1項(xiàng)提取的禽結(jié)核分枝桿菌參考菌株(CVCC 68201)基因組DNA測(cè)定濃度后，用雙蒸水梯度稀釋成1.5、0.75、0.38、0.19、0.09和0.05 ng/μL，用1.4.1優(yōu)化的多重PCR進(jìn)行檢測(cè)和電泳，確定其對(duì)基因組DNA的最小檢測(cè)量。

1.4.3 多重PCR特異性檢測(cè)

1.4.3.1 禽分枝桿菌各亞種代表性菌株基因組DNA提取 提取禽分枝桿菌各亞種代表菌株CVCC 68201(禽亞種/森林土壤亞種)、CVCC 323(副結(jié)核亞種)、CVCC 280(人豬亞種)的基因組DNA，并選擇牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC 68001、CVCC 68002、CVCC 291的基因組DNA作為對(duì)照，運(yùn)用1.4.1優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系檢測(cè)和電泳，確定特異性檢測(cè)結(jié)果。

1.4.3.2 禽分枝桿菌各亞種的多重PCR判定標(biāo)準(zhǔn)

多重PCR檢測(cè)的擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)三條目的條帶，則判為禽分枝桿菌禽亞種/禽分枝桿菌森林土壤亞種; 多重PCR檢測(cè)的擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)兩條目的條帶，則判為禽分枝桿菌人豬亞種；多重PCR檢測(cè)的擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)215 bp(IS900基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)兩條目的條帶，則判為禽分枝桿菌副結(jié)核亞種。

1.5 多重PCR對(duì)禽分枝桿菌菌種的鑒定 提取國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心保存的23株禽分枝桿菌基因組DNA，運(yùn)用1.4.1優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系檢測(cè)和電泳，并根據(jù)1.4.3.2判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，判定與菌種目錄[14]收載結(jié)果的一致性。

2 結(jié) 果

2.1 多重PCR體系退火溫度確定 由圖1可知，當(dāng)退火溫度設(shè)定為50 ℃～62 ℃時(shí)，利用多重PCR檢測(cè)體系均能有效擴(kuò)增出目的基因，但以56 ℃～60 ℃的退火溫度最佳。

2.2 多重PCR靈敏度(最小檢測(cè)量)結(jié)果 由圖2可知，隨著反應(yīng)體系中模板濃度的降低，多重PCR的最低檢測(cè)限度為0.38 ng/μL。

2.3 多重PCR特異性測(cè)定結(jié)果 由圖3看出，牛分枝桿菌僅能擴(kuò)增出140 bp條帶，禽分枝桿菌各亞種代表菌株均能擴(kuò)增出140 bp條帶，禽亞種/森林土壤亞種擴(kuò)增出140 bp、385 bp、577 bp條帶，副結(jié)核亞種擴(kuò)增出140 bp、215 bp條帶，人豬亞種擴(kuò)增出140 bp、385 bp條帶。

2.4 23株標(biāo)準(zhǔn)菌株的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果 由圖4看出，所涉及的23株禽分枝桿菌，菌株CVCC 281、CVCC 283、CVCC 284、CVCC 280、CVCC 282為人豬亞種，可擴(kuò)增出140 bp、385 bp條帶；菌株CVCC 1646和CVCC 1625為副結(jié)核亞種，可擴(kuò)增出140 bp、215 bp條帶；其他菌株均為禽亞種/森林土壤亞種，可擴(kuò)增出140 bp、385 bp、577 bp條帶。該結(jié)果與菌種目錄[14]中收載結(jié)果一致。

3 討 論

多重PCR因其快速、靈敏度高等特點(diǎn)尤其適用于禽分枝桿菌這種具有一定生物安全風(fēng)險(xiǎn)的病原鑒定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)外最新研究進(jìn)展[13]和國(guó)內(nèi)23株禽分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在此方面開(kāi)展研究，對(duì)多重PCR特異性進(jìn)行了驗(yàn)證并確認(rèn)了最低核酸檢測(cè)限度0.38 ng/μL。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，多重PCR體系采用常規(guī)PCR商品化Premix Taq，既實(shí)現(xiàn)了目的條帶有效擴(kuò)增又有效避免了dNTP濃度、Mg2+濃度等因素的影響。多重PCR技術(shù)對(duì)退火溫度要求很高[16]，考慮到實(shí)驗(yàn)室及PCR儀不同可能會(huì)導(dǎo)致退火溫度的差異，從而對(duì)多重PCR結(jié)果產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)了7個(gè)梯度的退火溫度(50～62 ℃)，均能擴(kuò)增出特異性目的條帶(以56～60 ℃為最佳)，表明該技術(shù)具有推廣價(jià)值。

根據(jù)多重PCR產(chǎn)物條帶情況可以將禽分枝桿菌復(fù)合體細(xì)分為符合致病性和宿主特點(diǎn)的亞種：禽亞種/森林土壤亞種(140 bp+385 bp+577 bp)、副結(jié)核亞種(140 bp+215 bp)、人豬亞種(140 bp+385 bp)。通過(guò)多重PCR方法還將同為血清3型的菌株CVCC 277與菌株CVCC 280進(jìn)一步細(xì)分為菌株CVCC 277(禽亞種/森林土壤亞種)與菌株CVCC 280(人豬亞種)，一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法的不足。

該多重PCR方法尚不能區(qū)分鳥(niǎo)亞種與森林土壤亞種。因?yàn)閮烧呋蚪MDNA序列極其相似，即使16S rRNA測(cè)序等方法也無(wú)法區(qū)分鳥(niǎo)亞種與森林土壤亞種。也正因?yàn)槿绱耍琓urenne等[17]認(rèn)為森林土壤亞種就是禽亞種。人們目前只能根據(jù)原代培養(yǎng)森林土壤亞種時(shí)要添加草分枝菌素等培養(yǎng)特性來(lái)實(shí)現(xiàn)禽亞種與森林土壤亞種的鑒別[6]。

鑒于本實(shí)驗(yàn)中所用的菌株均為參考菌株，下一步工作仍需收集野外分離株進(jìn)行驗(yàn)證。另外，該多重PCR方法不能區(qū)分禽亞種與森林土壤亞種，將有待進(jìn)一步研究。

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UseofMultiplexPCRAssayfortheIdentificationofMycobacteriumaviumSub-species

ZHANG Ge1, PENG Yong1, LIU Guo-quan1, JIANG Hui1, FENG Yu2, ZHU Liang-quan1*, DING Jia-bo1*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAgricultureUniversity,Tai'an,Shandong271018,China)

ZHULiang-quan,E-mail:zhuliangquan9990@hotmail.com;DINGJia-bo,E-mail:dingjiabo@126.com

In order to establish a multiplex PCR method forMycobacteriumavium(M.avium), four specific primers were designed according to the diagnostic methods reported in foreign countries. The genomic DNA of bovine tuberculosis reference strain (CVCC 68201) was selected as the template, the minimum detection amount of DNA was determined, the annealing temperature was optimized and the specificity was tested. TheMycobacteriumaviumstandard strains preserved by the China Veterinary Culture Collection Center (CVCC) were tested and classified by the optimized multiplex PCR system. The results showed that the reference strain (CVCC 68201) could amplify bands of 577 bp (IS901 gene fragment), 385 bp (IS1245 gene fragment) and 140 bp (dnaJ gene fragment), and the minimum detectable amount of genomic DNA is 0.38 ng/μL, the purpose bands can be effectively amplified between the annealing temperature of 50 ℃～62 ℃. Twenty-three strains ofMycobacteriumaviumwere detected and theMycobacteriumboviswas used as negative control. TheMycobacteriumaviumisolates were divided into three categories:M.aviumsubsp.avium/M.aviumsubsp.silvaticum,M.aviumsubsp.hominissuis,M.aviumsubsp.paratuberculosis. Compared with the classification results of China Veterinary Culture Collection Center, our results are not only consistent but also more detailed and of clinical significance. Therefore, the multiplex PCR method based on molecular biology method can rapidly identify the subtype ofMycobacteriumaviumand provide reference for the diagnosis of avium tuberculosis.

Mycobacteriumavium; subtype identification; multiplex PCR

2017-04-05

A

1002-1280 (2017) 10-0011-07

S852.6

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500902)

張 閣，碩士研究生，從事人畜共患傳染病研究。

朱良全，E-mail：zhuliangquan9990@hotmail.com；丁家波，E-mail：dingjiabo@126.com

(編輯：李文平)