白沙沙，趙 萌，于佳立，陳月曉，崔亞娟

(1北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100094)

不同品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量的比較研究

白沙沙1，趙 萌1，于佳立2，陳月曉1，崔亞娟1

(1北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100094)

建立了酶解法(葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶)測定小麥籽粒中的β-葡聚糖含量，對該方法的標(biāo)品測定回收率和加標(biāo)回收率進(jìn)行研究，利用該方法測定了8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量，并分析其含量的差異性。結(jié)果表明：酶解法具有良好的測定結(jié)果；8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量在0.44%～0.68%之間，小麥籽粒中β-葡聚糖含量由于品種和產(chǎn)地的不同而呈現(xiàn)一定的差異性，試驗(yàn)結(jié)果為從膳食中攝入β-葡萄糖提供了參考。

小麥；β-葡聚糖；酶解法

β-葡聚糖廣泛存在于植物、微生物和動物體內(nèi)，具有抗腫瘤、抗炎、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖、降血脂、提高人體免疫力等[1-5]多種生理功能，對慢性病的預(yù)防和調(diào)理具有重要意義。小麥及其制品是人們?nèi)粘Ｉ攀车闹饕任?，中國居民膳食指南推薦每人每日攝入量在250～400g[6]，因此研究測定不同品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量對篩選和培育富含β-葡聚糖的小麥品種具有指導(dǎo)作用，為從膳食中攝入β-葡聚糖提供了參考[7，8]。

β-葡聚糖含量的測定方法主要有酶解法、苯酚-硫酸法、剛果紅法、熒光法、高效液相色譜法[9-15 ]等。酶解法測定谷物β-葡聚糖是利用特定的β-葡聚糖內(nèi)切酶酶解得到寡糖，經(jīng)葡萄糖苷酶水解后采用葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶試劑測定葡萄糖的含量，該內(nèi)切酶主要是針對(1，3)、(1，4)糖苷鍵鏈接的β-葡聚糖，酶法專一性酶解β-葡聚糖，其測定含量準(zhǔn)確可靠，AOAC992.28[16]、AOAC995.16[17]方法和我國農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2006-2011[18]測定谷物大麥及燕麥中β-葡聚糖含量均為酶解法。

酶解法是利用葡聚糖酶專一性水解(1，3)、(1，4)-β-D-葡聚糖[19]生成寡糖，利用β-葡萄糖苷酶將寡糖水解成葡萄糖，葡萄糖氧化酶酶解葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，在過氧化氫酶作用下過氧化氫與4-氨基安替比林氧化縮合生成紅色醌類化合物，510nm處測定吸光度值，其吸光度值與葡萄糖含量成正比，根據(jù)葡萄糖轉(zhuǎn)化β-葡聚糖脫水轉(zhuǎn)換因子可以求得β-葡聚糖含量。本研究以8個品種小麥籽粒為試驗(yàn)材料采用酶解法測定其β-葡聚糖含量，利用統(tǒng)計(jì)分析法確定8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 小麥樣品制備 本實(shí)驗(yàn)選擇2015年夏季收獲的冬小麥，品種為：衡觀35(河南輝縣)、西農(nóng)979(河南輝縣)、濟(jì)麥22(河北邢臺)、小偃22(西安楊凌)、老麥16(河北邢臺)、周麥16(河南鶴壁)、小寶豐(河南鶴壁)和農(nóng)夫399(河北邯鄲)共8個品種。

樣品制備：小麥?zhǔn)斋@脫粒除雜除塵后自然晾曬至干燥。干燥后的小麥籽粒用萬能粉碎機(jī)磨成全麥粉，過40目篩，烘干至恒質(zhì)量，備用。

1.1.2 主要試劑 乙醇：分析純，北京化工廠；磷酸二氫鈉：分析純，北京化工廠；乙酸鈉：分析純，北京化工廠；酶試劑及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)購自愛爾蘭Megazyme公司，其中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1mg/mL，葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶-過氧化物酶緩沖液混合物均按照酶試劑說明進(jìn)行配置。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20、40、60、80、100μL于試管中，分別添加50mmol/L乙酸鈉緩沖液至200μL，得到試管中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分別為20、40、60、80、100μg。試劑空白為200μL 50mmol/L乙酸鈉緩沖液。

1.2 儀器和設(shè)備

粉碎機(jī)：A11 basic，德國IKA公司；高速冷凍離心機(jī)：RXⅡ，日本HITACHI公司；漩渦振蕩器：XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；分光光度計(jì)：722S，上海精密科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋：DZKW-4六孔，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 酶解處理

精確稱取粉碎待測樣于試管中(精確至0.0001g)。向待測試管中加入0.2mL 50%乙醇溶液，漩渦震蕩分散；加入4.0mL磷酸鈉緩沖液，充分震蕩。將試管放入沸水浴中保持1min，漩渦震蕩數(shù)秒，沸水浴中繼續(xù)保持2min，漩渦震蕩。

1.3.1 葡聚糖酶酶解 取出試管后于50℃水浴中保溫5min，添加0.2mL葡聚糖酶溶液，漩渦震蕩數(shù)秒，加蓋，50℃水浴保溫60min，其間將試管取出震蕩處理3～4次。此步驟葡聚糖酶將(1，3)、(1，4)-β-D-葡聚糖酶解生成寡糖。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶酶解 取出試管，向其中加入5mL 200mmol/L乙酸鈉緩沖液，混合均勻，室溫下冷卻，離心(1 000×g、10min)，取上清液，備用。分別準(zhǔn)確移取0.1mL上清液于試管底部，向其中分別添加0.1mL β-葡萄糖苷酶溶液，反映空白添加0.1mL 50mmol/L乙酸鈉緩沖液，各試管在50℃下保溫10min。此步驟β-葡萄糖苷酶將寡糖水解成葡萄糖。

1.3.3 顯色反映 分別移取3.0mL葡萄糖氧化酶-過氧化物酶緩沖液混合物至各試管，50℃下反應(yīng)20min，冷卻至室溫。葡萄糖氧化酶酶解葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，在過氧化氫酶作用下過氧化氫與4-氨基安替比林氧化縮合生成紅色醌類化合物。

1.4 比色測定

以試劑空白調(diào)零，于510nm處測定吸光度值。

1.5 計(jì)算

按照式(1)計(jì)算樣品中β-葡聚糖含量(%)：β-葡聚糖含量[18]=△A×F×94×10-4×0.9/W

(1)

式(1)中，△A：樣品吸光值與反應(yīng)空白吸光值的差值；F：吸光值轉(zhuǎn)化為μg葡萄糖的轉(zhuǎn)換因子；94：體積校正因子(從9.4mL吸取0.1mL用于分析)；0.9：葡萄糖轉(zhuǎn)化為β-葡聚糖的脫水轉(zhuǎn)換因子；W：樣品質(zhì)量，g。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確移取1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0、20、40、60、80、100μL于6支試管中，分別添加50mmol/L乙酸鈉緩沖液至200μL，使得每管中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量為0、20、40、60、80、100μg。移取3.0mL葡萄糖氧化酶-過氧化物酶緩沖液混合物至各試管，在50℃水浴條件下反應(yīng)20min，取出冷卻至室溫。于510nm處以試劑空白(即0μg試管)調(diào)零，測定各試管吸光度值。吸光度A與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程(附圖)。

附圖 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 燕麥粉標(biāo)準(zhǔn)品的測定

采用該方法測定β-葡聚糖標(biāo)示量為8%的燕麥粉標(biāo)準(zhǔn)品中β-葡聚糖含量，準(zhǔn)確稱取0.1g(精確至0.000 1g)燕麥粉標(biāo)準(zhǔn)品，平行測定3次，結(jié)果分別為8.13%、8.12%和7.93%，測定回收率分別為101.6%、101.5%和99.1%，說明該方法具有良好的測定回收率，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要。

2.3 加標(biāo)回收率測定

以8%含量燕麥粉標(biāo)準(zhǔn)品添加入空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。進(jìn)行3個標(biāo)準(zhǔn)添加水平的回收率試驗(yàn)，每個添加水平重復(fù)測定3次，分別計(jì)算加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差，β-葡聚糖3個水平的平均加標(biāo)回收率在98.2%～101.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.86%～4.75%(表1)，能夠滿足檢測實(shí)際樣品需要。

表1 β-葡聚糖加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果 單位：%

2.4 不同品種小麥籽粒β-葡聚糖含量的測定

按照上述驗(yàn)證的酶解法分別對8個品種小麥籽粒制備的籽粒粉進(jìn)行β-葡聚糖含量的測定，每個品種進(jìn)行4次平行測定，統(tǒng)計(jì)4次測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。表2結(jié)果顯示，8個小麥品種β-葡聚糖含量在0.40%～0.71%，標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.19%～3.73%。其中衡觀35小麥籽粒中β-葡聚糖含量最低，為0.44%；β-葡聚糖含量最高的小麥品種為農(nóng)夫399，為0.68%，是衡觀35小麥籽粒中β-葡聚糖含量的1.6倍左右。為判斷8個小麥品種籽粒中β-葡聚糖含量的差異性，進(jìn)一步對測定結(jié)果進(jìn)行方差分析。

表2 8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量

經(jīng)過SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量進(jìn)行方差分析，表3結(jié)果顯示，含量最低的衡觀35與其余7個品種在P<0.01水平均具有顯著差異；西農(nóng)979與濟(jì)麥22、小寶豐的β-葡聚糖含量差異不顯著，與其他5個品種在P<0.01水平具有顯著差異；濟(jì)麥22與老麥16的β-葡聚糖含量差異不顯著，與小偃22、小寶豐的β-葡聚糖含量在P<0.05水平具有顯著差異，與周麥16、農(nóng)夫399的β-葡聚糖含量在P<0.01水平具有顯著差異；小偃22與老麥16的β-葡聚糖含量差異不顯著，與周麥16、小寶豐、農(nóng)夫399的β-葡聚糖含量在P<0.01水平具有顯著差異；老麥16與周麥16、小寶豐、農(nóng)夫399的β-葡聚糖含量在P<0.01水平具有顯著差異；周麥16與小寶豐、農(nóng)夫399的β-葡聚糖含量在P<0.01水平具有顯著差異；小寶豐與農(nóng)夫399的β-葡聚糖含量在P<0.01水平具有顯著差異。

采自河南輝縣的衡觀35和西農(nóng)979、河北邢臺的濟(jì)麥22和老麥16、河南鶴壁的周麥16和小寶豐，同一產(chǎn)地的不同品種在P<0.01水平具有顯著差異，品種的不同對小麥籽粒β-葡聚糖含量具有顯著的差異性。

表3 8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量差異顯著性

3 結(jié)論

本文建立了酶解法測定β-葡聚糖含量，并研究了該方法的標(biāo)品測定回收率和加標(biāo)回收率，通過對β-葡聚糖標(biāo)示量為8%的燕麥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行酶解測定，測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值一致，說明酶分解測定β-葡聚糖含量具有良好的測定結(jié)果；通過樣品加標(biāo)回收測定回收率，低、中、高3個添加水平測得回收率在98.2%～101.1%之間，該方法穩(wěn)定、干擾少。

通過酶解法對衡觀35、西農(nóng)979、濟(jì)麥22、小偃22、老麥16、周麥16、小寶豐和農(nóng)夫399共8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，8個品種小麥籽粒中β-葡聚糖含量在0.40%～0.71%之間。

對8個品種小麥籽粒β-葡聚糖含量的差異性分析得到：西農(nóng)979與濟(jì)麥22、小寶豐的β-葡聚糖含量差異不顯著；濟(jì)麥22與老麥16的β-葡聚糖含量差異不顯著；小偃22與老麥16的β-葡聚糖含量差異不顯著；其他品種間β-葡聚糖含量均具有一定的顯著性差異。進(jìn)一步分析得到同一產(chǎn)地的不同品種間β-葡聚糖含量存在顯著差異，說明品種的不同是產(chǎn)生β-葡聚糖含量差異的因素。

4 討論

酶解法測定小麥籽粒中β-葡聚糖含量的文章未見報道，本研究8種小麥籽粒中β-葡聚糖含量測定結(jié)果在0.40%～0.71%，與單賀年[20]利用HPGPC法(高效凝膠滲透色譜法)測定不同品種小麥β-葡聚糖含量范圍在0.42%～0.61%具有一致性。小麥中β-葡聚糖含量雖低于燕麥和大麥[19]等谷物中β-葡聚糖含量(燕麥3%～7%，大麥5%～11%)，基于小麥制品的日攝取量大，篩選和育種β-葡聚糖含量較高的小麥品種對慢性病的預(yù)防和調(diào)理具有重要意義。

本研究對小麥籽粒中β-葡聚糖含量的測定結(jié)果為進(jìn)一步研究小麥籽粒不同組織結(jié)構(gòu)中(如麩皮、胚乳、糊粉層等)β-葡聚糖的含量提供了基礎(chǔ)，進(jìn)一步測定和分析小麥籽粒不同組織結(jié)構(gòu)β-葡聚糖含量，為小麥深加工和開發(fā)β-葡聚糖功能性產(chǎn)品，促進(jìn)谷物β-葡聚糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有的指導(dǎo)意義?！?/p>

[1]蔡成剛，蔣新龍，蔣昌海.β-葡聚糖結(jié)構(gòu)功能與開發(fā)研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2011，9：114-117.

[2]Judith H，Daniel J S，Kay M B.Physiological responses of men and women to barley and oat extracts(Nu-trimx).II.Comparision of glucose and insulin response[J]. Cereal Chemistry，2003，80(3)：80-83.

[3]Tapola N，et al.Glycemic responses of oat bran products in type 2 diabetic patients[J].Nutrition，Metabolism & Cardiovascular Diseases，2005，15：225-261.

[4]Volman J J，et al.Dietary modulation of immune function by β-glucans[J]. Physiology & Behavior，2008，94：276-284.

[5]El Khoury D，Cuda C，Luhovyy L L，et al.Beta Glucan：Health Benefits in Obesity and Metabolic Syndrome[J]. Journal of Nutrition and Metabolism，2012，12：851362.

[6]中國營養(yǎng)學(xué)會.《中國居民膳食指南》[M].抗薩：西藏人民出版社，2011.

[7]Adam M B，Brigid T, Kristin K,et al.Major Cereal Grain Fibers and Psyllium in Ralation to Cardiovascular Health[J].Nutrients，2013，5：1471-1487.

[8]金玉紅，張開利，張興春，等.小麥組分含量與小麥芽β-葡聚糖酶活力的相關(guān)性分析[J].中國糧油學(xué)報，2008，23(5)：28-32.

[9]熊茉君，王 新，張紅霞.β-葡聚糖含量測定方法的比較[J].華西藥學(xué)雜志，2005，20(5)：438-440.

[10]張娟，杜先鋒，饒硯琴.剛果紅法測定燕麥中β-葡聚糖含量的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，34(1)：23-26.

[11]連喜軍，魯曉翔，劉勤生，等.熒光素鈉法測定β-葡聚糖含量的研究[J].食品研究與開發(fā)，2006，27(10)：116-119.

[12]徐建光，梁達(dá)奉，曾練強(qiáng)，等.酶解法定量測定葡聚糖的研究[J].化學(xué)與生物工程，2010，27(4)：92-94.

[13]連喜軍，魯曉翔，蔡保松.酶法測定大麥提取物葡聚糖含量研究[J].糧食與油脂，2006，5：12-15.

[14]宋 萍，李文俊.青稞秸稈中β-葡聚糖含量的測定[J].特產(chǎn)研究，2009，1：50-52.

[15]呂耀昌，王強(qiáng)，趙煒，等.燕麥、大麥中β-葡聚糖的酶法測定[J]. 食品科學(xué)，2005，26(1)：180-182.

[16]AOAC Official Method 992.28.(1→3)(1→4)-Beta-D-Glucans in Oat and Barley Fractions and Ready-To-Eat Cereals：1992.

[17]AOAC Official Method 995.16.β-D-Glucan in Barley and Oats Streamlined Enzymatic Method：1995.

[18]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工局.NY/T2006-2011.谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定[S].

[19]申瑞玲，何俊，趙學(xué)偉.谷物β-葡聚糖的提取方法、化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2009，30(3)：288-291.

[20]單賀年，鞠興榮，袁建，等.HPGPC測定麥類中β-葡聚糖含量[J].糧食與食品工業(yè)，2014，21(6)：72-77.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Content Comparison of β-Glucan in Different Varieties of Wheat Grain

BAI Sha-sha1，ZHAO Meng1，YU Jia-li2，CHEN Yue-xiao1，CUI Ya-juan1

(1Beijing Research Institute for Nutritional Resources，Beijing 100069,China；2Beijing City University，Beijing 100094,China)

The Enzymatic Hydrolysis Method including dextranase，β-glucosidase，glucose oxidase and catalase was established for the determination on the content of β-glucan in wheat grain.The standard determination recovery rate and sample added recovery rate of the method were investigated and the differences of the β-glucan contents from 8 varieties of wheat grain were compared.The results showed that the Enzymatic Hydrolysis Method had good determination results，and the β-glucan content of 8 varieties of wheat grain were between 0.44% and 0.68%.Differencs were found in the β-glucan content among different varieties.This results provided new insight into the consumption of β-glucan from diet.

wheat；β-glucan；Enzymatic Hydrolysis Method

北京市級財政項(xiàng)目“食物中四類植物化學(xué)物檢測技術(shù)的開發(fā)改進(jìn)及植物化學(xué)物配方食品加工方法研究”(項(xiàng)目編號：PXM2014_178102_000011)。

白沙沙(1987— )，女，碩士，中級工程師，研究方向：食品分析。

崔亞娟(1979— )，女，博士，研究員，研究方向：食品分析。