劉淑梅* 李芳蓉陳軍

（1甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū)生化系，甘肅 定西 743000）（2甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū)物電系，甘肅 定西 743000）項目號：定西師范高等專科學校資助項目（No.TD2016ZD05）

基于文獻研究的生物多糖提取中的分離純化技術(shù)研究綜述

劉淑梅* 李芳蓉1陳軍2

（1甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū)生化系，甘肅 定西 743000）（2甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū)物電系，甘肅 定西 743000）項目號：定西師范高等專科學校資助項目（No.TD2016ZD05）

存在于動植物及微生物組織中的某些生物多糖，因具有促進機體免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、抗炎、降低血脂以及改善動物生產(chǎn)性能等一系列生物活性作用而成為二十一世紀的研究熱點。其中，獲取單一、純凈的生物多糖是生物多糖功效研究的基礎(chǔ)。本文基于文獻研究的基礎(chǔ)上，綜述多糖提取中去除多種非多糖雜質(zhì)組分的技術(shù)，為多糖分離純化提供一定的技術(shù)支持。

生物多糖；分離純化；研究；綜述。

1 、引言

多糖既是生物體的能源物質(zhì)，也是生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，還參與多種重要的生命活動。生物多糖是蘊藏生命奧秘和主宰生命活動的三類生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)和多糖）之一，但多糖的研究層次和水平遠遠落后于核酸和蛋白質(zhì)（姜輝）。自1988年，牛津大學的幾位教授首次提出了“糖生物學”的概念之后，日本、美國、歐盟分別開啟了關(guān)于多糖的研究計劃。日本科學家們提出了關(guān)于“糖工程基礎(chǔ)與應用研究推進戰(zhàn)略”方案，并預定在1991年實施“糖工程前沿計劃”；美國啟動了“功能糖組學計劃”；歐盟啟動了“歐盟糖研究與開發(fā)平臺”。日本學者認為：以多糖結(jié)構(gòu)、功能和應用為核心的糖工程是繼蛋白質(zhì)工程和基因工程之后生物化學和分子生物學領(lǐng)域中最重要的科學前沿，提出人類對多糖的深入認識將有助于進一步認識自身，并預言了糖生物學的到來，預示21世紀將是多糖生命科學的時代(Joseph A2001;Jian X et al.,2003)?！禨cienctific American》對多糖報道時稱“沒有蛋白質(zhì)就沒有生命，但是沒有多糖沒有活力”，高度概括了多糖對于生命活動的重要性。

多糖雖然廣泛存在于生物機體內(nèi)，但往往與其他物質(zhì)緊密結(jié)合形成結(jié)構(gòu)復雜的復合物，所以，從有機體組織中提取的粗多糖，不同程度的混有無機鹽、蛋白質(zhì)、色素及醇不溶的小分子有機物(如低聚糖)等雜質(zhì)，獲得單一組分的多糖是多糖提取中研究的重要內(nèi)容之一，也是多糖生物學功效研究的基礎(chǔ)。本文在大量研讀相關(guān)文獻的的基礎(chǔ)上，綜述多糖提取中的分離純化技術(shù)。

2 、多糖提取中的分離純化

多糖的分離純化，就是將粗多糖中的非多糖組分雜質(zhì)性質(zhì)采取相對應的分離措施。

2.1 蛋白的脫除

生物細胞膜上的多糖大多與蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白，所以提取的細胞膜多糖中含有一定量的蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)就是利用蛋白質(zhì)與多糖成分在不同溶劑中的特性除去蛋白質(zhì)或者溶出多糖。傳統(tǒng)的方法有機溶劑法、酶法與Sevage法聯(lián)用[1]、樹脂柱層析法和等電點法[2]等。較為常用的有：

2.1.1.有機溶劑法

如氯仿-正丁醇(Sevage)法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法等。

氯仿-Sevage法 是利用蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中變性的特點，將氯仿與正丁醇（或正戊醇）按4:1比例混合后，再與多糖提取液等體積混合，之后反復振搖10min，蛋白質(zhì)變性成膠狀，存在于水相和溶劑的交界面上，然后離心，取上層糖液重復上述操作，直至無蛋白析出為止。Sevag法是經(jīng)典的去除蛋白的方法，作用條件較溫和，可避免多糖的降解，但需要多次處理才能除凈蛋白質(zhì)，費時費力，且多糖和有機溶劑損耗較大。

三氯乙酸法[3]是在粗多糖液中加入三氯乙酸使其濃度達到10%[4] ，4℃條件下放置過夜，離心，棄沉淀。三氯乙酸法脫蛋白效率較高，濃度越大、除蛋白質(zhì)效果越好，但三氯乙酸易造成糖苷鍵斷裂，使多糖發(fā)生降解，且多糖損失隨三氯乙酸濃度增大而增大。

三氟三氯乙烷法[5]，將多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合，在4℃下攪拌10min左右，蛋白質(zhì)成膠凍狀，離心得上層溶液，上層溶液繼續(xù)用上述方法處理幾次，即得無蛋白的多糖溶液。有機溶劑法去除蛋白質(zhì)溶劑容易殘留，為了提高效率，減少試劑使用。

2.1.2 酶法與Sevage法聯(lián)用

多糖提取液中加入2%的胰蛋白酶[6]，在37℃恒溫水浴鍋中溫浴兩個小時，然后用Sevage法脫蛋白，直至無蛋白析出。酶法與Sevage法聯(lián)用較之Sevage法效率高、有機溶劑損耗少。等電點法脫蛋白用1mmol.L-1鹽酸調(diào)節(jié)多糖提取液pH值至3，4℃條件下放置過夜，離心，棄沉淀得脫蛋白液。

2.1.3 樹脂柱層析法分離脫蛋白是近些年常用的脫蛋白技術(shù)。

樹脂柱層析法分離技術(shù)脫蛋白，不僅除蛋白效果好，而且多糖回收率較高、處理條件溫和、操作簡便、洗脫液為蒸餾水，較好保持了多糖的生物活性[7]。

2.2 脫色

植物多糖提取物中常含酚類物質(zhì)，因氧化而生成色素，影響多糖的色譜分析和性質(zhì)測定。根據(jù)色素性質(zhì)不同，可用氧化劑、吸附劑、離子交換劑等脫除。氧化劑常為雙氧水，雙氧水是通過氧化色素物質(zhì)而脫色，卻不能除去色素物質(zhì)，需要進一步采取措施才能去除。使用雙氧水要注意:雙氧水是強氧化劑，濃度過高會引起多糖的降解和結(jié)構(gòu)的變化。用吸附劑、離子交換劑等脫除色素，方法比較溫和。吸附劑有纖維素、聚酰胺、活性炭、大孔樹脂、硅藻土、高嶺土等[8][9]，其中樹脂和聚酰胺脫色效果較好，且不易造成多糖大量流失，活性炭對多糖吸附較為嚴重，損失較大。目前最常用是以二乙氨乙基纖維素(DEAECellulose)為離子交換劑的脫色方法[10]，因為對酸性多糖的吸附力強，而造成損失多，提取酸性多糖不宜。樹脂柱層析法不僅能達到脫色的目的，而且可以實現(xiàn)多糖、核酸、中性和酸性蛋白等的分離，其應用前景廣泛。方積年實驗室又發(fā)明了一種新的多糖脫色方法，即采用十六烷基三甲基溴化銨-正己醇-異辛烷組成的反膠束溶液，在一定的鹽濃度下，對多糖粗品進行脫色，此方法已獲得專利。對于脫色方法的選擇，可依據(jù)多糖的組成，性質(zhì)和產(chǎn)品的用途，選擇合適的脫色方法。

2.3 去脂

為了除去多糖中的脂類成分，提取之前可以先用甲醇-氯仿、石油醚、丙酮等除去脂肪酸等脂溶性成分?；蛘呤翘崛『笥盟蝗艿挠袡C溶劑如氯仿等進行萃取，以除去脂溶性化合物。也可以采用堿性水解，使脂類分解，再透析去除分解產(chǎn)物[11]。

2.4 脫小分子雜質(zhì)

透析是去除無機鹽等小分子的有效手段，將多糖溶液放入一定截留分子量的透析袋中，在自來水或蒸餾水中透析，無機鹽、單糖、低聚糖、氨基酸和部分色素等小分子物質(zhì)滲出透析膜，而大分子物質(zhì)仍保留在溶液中，該方法操作簡單，但處理量少，操作時間較長。

3 、多糖的分級純化研究

經(jīng)過除雜后的多糖仍是混合物，其化學組成、聚合度、分子形狀等具有不一致性。要得到組成、聚合度、分子形狀等一致的多糖組分，需對該混合物進行分級純化。常用的分級方法有離子交換柱層析、超濾、凝膠柱層析法等。

3.1 離子交換柱層析

是目前多糖純化中應用最廣的一種方法，利用離子交換劑對需要分離的各種離子具有不同的親和力(靜電引力)而達到分離目的。對于體積較大的多糖溶液，大多采取陰離子交換柱層析純化。使多糖得到初步純化，甚至可以分離到一致性組分。應用最廣泛的交換劑(填料)有二乙氨乙基纖維素(DEAE-Cellulose)、DEAE-葡聚糖(DEAE-sephadex)及DEAE-瓊脂糖(DEAE-sepharose)三種，分為硼砂型和堿型，洗脫劑可用不同濃度堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優(yōu)點可吸附雜質(zhì)、純化多糖，并適用于分離各種酸性、中性多糖和黏多糖。如玉郎傘多糖[12]、藍莓多糖[13]等的分離。離子交換柱分離糖類可先有效地去除多糖水溶液中的酸性成分，堿性成分和去除無機離子，所剩下的和糖苷繼續(xù)分離，但不適合用強酸性和強堿性樹脂。

3.2 超濾技術(shù)

是近年發(fā)展起來的膜分離技術(shù)，也叫透析法。此種方法的關(guān)鍵是要選擇孔目合適的透析膜。如，纖維膜孔徑為2-3nm，可使無機鹽或單糖分子通過，使多糖與無機鹽或單糖分子分離效果較好；孔徑較大時(3-5nm)，透析加速，甚至可使雙糖分子通過，可實現(xiàn)多糖與雙糖的分離。該技術(shù)不易破壞多糖的生物活性、能耗低、環(huán)境污染，適于工業(yè)化生產(chǎn)，如中藥多糖、海洋多糖、發(fā)酵多糖、食用植物多糖等[14]。但由于大多數(shù)超濾膜能吸附多糖，死體積大，使其得率大大降低。

3.3 凝膠柱層析

實際上起分子篩作用，是目前植物多糖最常用的高級純化方法。當溶液通過網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠粒時，小分子物質(zhì)自由擴散于凝膠粒的孔隙中，大分子物質(zhì)則被排阻于凝膠粒外。在洗脫劑作用下，最大分子的物質(zhì)最先流出，最后流出的洗脫液中含有最小分子的物質(zhì)。依次分段收集洗脫液則可得到不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)。

在多糖分離純化中常用的凝膠材料有葡聚糖凝膠系列(Sephadex)、丙烯葡聚糖凝膠系列(Sephacryl)、天然瓊脂糖凝膠系列(Sepharose)以及上述凝膠的衍生物。實際應用中，常將DEAE-纖維素和葡聚糖凝膠聯(lián)用，分離效果更好[15]。如化橘紅多糖的分離純化，沙棘多糖[16]等的純化。

3.4 制備性高壓液相色譜((HPLC)

HPLC是在經(jīng)典柱層析原理的基礎(chǔ)上，流動相以高壓的方式注入柱內(nèi)，樣品組分就在流動相和固定相之間進行平衡分配，反復多次重復之后，樣品組分彼此分離，并向下遷移，各組分的遷移速率與其和固定相之間的相對親和力有關(guān)。

3.5 制備性區(qū)域電泳法

其原理是根據(jù)多糖分子的大小、形狀及其所負電荷的不同而在電場中的作用力不同而達到分離。玻璃粉是通常的載體。這種方法雖然分離效果好，但效率比較低，大規(guī)模應用不太實際。

3.6 分步沉淀法

依據(jù)不同的多糖在低級醇或酮中具有不同溶解度而進行分離的。分子量大的多糖在乙醇或丙酮中的溶解度相對較小，因此改變乙醇或丙酮的濃度可分離出不同分子量的多糖。此法非常簡便，在多糖純化中常常使用，但是只適宜于分離各種溶解度相差較大的多糖，并且最好將溶液pH值調(diào)到7.0附近，此時多糖的性質(zhì)較穩(wěn)定。如雪茶多糖提取時的乙醇分級沉淀來純化。

3.7 鹽析法

是根據(jù)各種多糖在不同鹽濃度中具有不同的溶解度的特性進行分離各種多糖?？稍诙嗵堑乃嵋褐屑尤霟o機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使多糖在水中溶解度降低析出，與其他水溶性較大的雜質(zhì)、多糖分離。鹽析法有成本低的優(yōu)點，但是效率不高易產(chǎn)生共沉淀，得到的多糖含有很多鹽類，必須經(jīng)過透析除鹽。常用的鹽有NaCl、KCl、(NH4)2SO4等，其中(NH4)2SO4方法最佳。如利用鹽析法提取仙人掌中的果膠，且實驗結(jié)果表明鹽析法比乙醇沉淀法要好[18]。

3.8 季按鹽沉淀法

季按鹽是一種常用的陽離子表面活性劑，長鏈季按鹽能與酸性多糖形成不溶性多糖化合物，從而達到分離純化酸性多糖的目的，常用的季按鹽有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和十六烷基吡啶(CPC)。

多糖的分級純化方法往往也可用于多糖的分離，使多糖的分離與分級純化可以同時進行，或者先分離再純化。一種分離、分級方法不能一次性地獲得一致性組分，只有綜合利用幾種方法才能達到純化的效果。

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A Summarization of Separation and Purification technology of Biological Polysaccharide Extraction Based on the Literature

LIU-Shumei1 LI-Fangrong1 CHEN-Jun2

(1.Department of Biochemistry, Dingxi Campus,GanSu University of Chinese Medicine ;2.Department of Physics and Electronic Engineering, Dingxi Campus,GanSu University of Chinese Medicine ,Dingxi Gansu 743000, China)

Exists in the plants and animals and microbes in the organization of some biological polysaccharide, for promoting the body immunity, antibacterial, antiviral, anti parasite, anti-tumor, anti-inflammatory, radiation resistance, anti-aging, reducing blood fat and improving animal production performance, and a series of biological active role and become the focus in the 21st century.Among them, accessing to a single, puring biological polysaccharide is the foundation of biological polysaccharide efficacy research.In this paper, summarizing to remove various impurity components of polysaccharides extracted polysaccharide technology based on literature research, provide certain technical support for the isolation and purification of polysaccharide.

Biological polysaccharide;Separation and purification;Research;review

R284

A