卞光明，胡則輝，柴學(xué)軍，王躍斌，胡成碩

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

·綜述·

SNP標(biāo)記技術(shù)及其在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)中的應(yīng)用

卞光明，胡則輝，柴學(xué)軍，王躍斌，胡成碩

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

單核苷酸多態(tài)性是最新型分子標(biāo)記技術(shù)，位點(diǎn)豐富、自動(dòng)化強(qiáng)，可以有效地應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)研究。本文結(jié)合近年研究成果，綜述了SNP特點(diǎn)及其在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的常用分型方法與應(yīng)用，分析了分型方法的優(yōu)劣，并對(duì)其應(yīng)用前景予以展望。

SNP；水產(chǎn)動(dòng)物；分型方法；應(yīng)用

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）指的是某種生物不同個(gè)體DNA序列中單個(gè)核苷酸點(diǎn)突變產(chǎn)生的多態(tài)性，包括置換、顛換、插入或缺失引起的多態(tài)現(xiàn)象[1]。SNP是由美國(guó)學(xué)者Lander于1996年提出的繼RFLP、SSR的第三代新型分子標(biāo)記技術(shù)[2]，1998～2002年每年都召開(kāi)“SNPs與復(fù)雜基因組”國(guó)際會(huì)議以探討SNPs在復(fù)雜基因組中應(yīng)用，隨著PCR、分型檢測(cè)、DNA芯片等技術(shù)的不斷發(fā)展，SNP趨于高通量、自動(dòng)化。近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)逐漸成為研究水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)的重要手段，SNP作為第三代遺傳標(biāo)記，位點(diǎn)數(shù)量多、密度廣、遺傳多樣性高以及自動(dòng)化程度強(qiáng)，能夠顯示其他分子標(biāo)記技術(shù)難以檢測(cè)到的遺傳信息多態(tài)性，故而，SNP標(biāo)記技術(shù)對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)研究具有重要意義。

1 SNP特點(diǎn)

SNP具有以下特點(diǎn)：①SNP可以通過(guò)對(duì)單個(gè)核苷酸的差異檢測(cè)來(lái)區(qū)分個(gè)體之間遺傳物質(zhì)的差異，由于CG序列中的胞嘧啶（C）極易自發(fā)脫氨轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），故而SNP等位基因多為（C）轉(zhuǎn)換為（T），只有通過(guò)專(zhuān)門(mén)的技術(shù)才可區(qū)分其間細(xì)微的差異[3]。②第一代的RFLP、第二代STR的遺傳特點(diǎn)是長(zhǎng)度差異，而SNP的遺傳特點(diǎn)是單個(gè)堿基的置換，在種群中呈二態(tài)性，在雙等位基因共顯性標(biāo)記提供的遺傳信息量小于SSR[4]，但是SNP在基因組中位點(diǎn)豐富、遺傳標(biāo)記密度高、遠(yuǎn)多于SSR，能夠?yàn)槿魏未芯炕蛱峁┖线m標(biāo)記，可彌補(bǔ)多態(tài)信息含量P（PIC）低于多等位基因SSR的缺陷[5-6]。③SNP的點(diǎn)突變率通常10-9，遺傳穩(wěn)定性遠(yuǎn)大于SSR等重復(fù)序列標(biāo)記[7]。④SNP在基因組中分布具有代表性，非同義編碼區(qū)SNP與蛋白質(zhì)的功能有關(guān)，從cDNA序列獲得的多態(tài)SNP標(biāo)記一定程度上可與控制性狀的基因連鎖。除此之外，基因調(diào)控區(qū)的SNP則會(huì)影響著基因表達(dá)量，對(duì)于疾病發(fā)生機(jī)制的研究具有重要意義[8-9]。⑤SNP基因分型不需要檢測(cè)片段長(zhǎng)度，可直接通過(guò)“全或無(wú)”分析，制成芯片開(kāi)展自動(dòng)化分析，一般可同時(shí)實(shí)現(xiàn)104～105個(gè)分型檢測(cè)[10]，SNP與其他分子標(biāo)記技術(shù)比較見(jiàn)表1。

表1 幾種常見(jiàn)分子標(biāo)記技術(shù)特點(diǎn)比較Tab.1 Comparison of characters of common molecular markers

2 SNP常用檢測(cè)分型方法

SNP基因分型方式多樣，檢測(cè)方法研究進(jìn)展報(bào)道較多[1,11-13,16]，但應(yīng)用在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)研究上的分型方法不多，常見(jiàn)的有直接測(cè)序法、PCR-SSCP、HRM以及自動(dòng)化強(qiáng)度較高的侵入檢測(cè)法、焦磷酸測(cè)序法和GoldenGate。

2.1 傳統(tǒng)分型方法

2.1.1 直接測(cè)序法

直接測(cè)序法是依托DNA測(cè)序手段來(lái)獲得堿基序列，并通過(guò)比較篩選出有效SNP位點(diǎn)的分型方法，一般可分為有PCR產(chǎn)物測(cè)序和克隆測(cè)序。邢賀飛[14]通過(guò)直接測(cè)序法對(duì)半滑舌鰨Cynoglossus semilaeviNarump基因進(jìn)行抗病SNP篩選，并篩選到15個(gè)SNP位點(diǎn)，其中有1個(gè)SNP位點(diǎn)在存活與死亡差異呈現(xiàn)顯著性，且等位基因（G）和基因型（GG）與抗鰻弧菌病呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，是半滑舌鰨抗病研究的一個(gè)良好的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。直接測(cè)序法需要設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能將雜合子篩選出，且位點(diǎn)有限，成本較高，但不需要通過(guò)多個(gè)位點(diǎn)分型來(lái)構(gòu)建遺傳圖譜，可以有效分析水產(chǎn)動(dòng)物遺傳信息的多樣性與性狀關(guān)聯(lián)，是最為常用的分型方法。

2.1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性指的是小于300 bp的DNA微小序列中單個(gè)堿基的變化所產(chǎn)生的構(gòu)象，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)生成的雙鏈DNA片段進(jìn)行低濃度變性解鏈處理，形成單鏈結(jié)構(gòu)，再對(duì)單鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行電泳分析[15]。李玉梅等[16]對(duì)PCR-SSCP技術(shù)的原理與研究進(jìn)展進(jìn)行詳述；馬瑞芹[17]運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)牙鲆Paralichthys olivaceus的CYP17-I編碼區(qū)的SNPs進(jìn)行了檢測(cè)，分析了兩個(gè)SNP位點(diǎn)中CT基因型與CC基因型個(gè)體血漿中的睪酮（T）水平差異以及CC基因型與TT基因型性腺指數(shù)（GSI）的顯著性，并構(gòu)建四種二倍型。PCR-SSCP成本經(jīng)濟(jì)，操作便捷，靈敏度高，ZHANG等[18]將非對(duì)稱(chēng)PCR-SSCP與傳統(tǒng)的PCR-SSCP進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者清晰穩(wěn)定、更適用于基因突變檢測(cè)，是PCR-SSCP技術(shù)發(fā)展重點(diǎn)。

2.1.3 高分辨率熔解曲線(xiàn)法（HRM）

高分辨率熔解曲線(xiàn)法是基于不同核酸物理性質(zhì)的差異，將熒光染料加入PCR反應(yīng)體系，當(dāng)含熒光染料的DNA解旋后，便可收集熒光信息形成熔解曲線(xiàn)[19]。當(dāng)DNA序列中某個(gè)堿基發(fā)生變化，熔解曲線(xiàn)便會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，便可通過(guò)軟件對(duì)遺傳信息進(jìn)行分析。逄錦菲[20]通過(guò)HRM技術(shù)對(duì)96尾中國(guó)對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了93個(gè)顯示多態(tài)性的SNPs，并對(duì)其群體抗性進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)抗性群體與敏感群體分布差異顯著。HRM技術(shù)通量高、操作簡(jiǎn)便、靈敏度和特異性強(qiáng)，可以準(zhǔn)確快捷地篩選SNP位點(diǎn)。SEEB等[21]運(yùn)用HRM技術(shù)在大麻哈魚(yú)Oncorhynchus keta 202個(gè)樣本中檢測(cè)出SNPs，其中有37個(gè)SNP位點(diǎn)滿(mǎn)足哈-溫平衡期望。目前大多HRM技術(shù)被商業(yè)化占用，缺少新技術(shù)革新的靈活性，LI等[22]介紹了基于數(shù)字圖像處理公共程序的高分辨率熔解曲線(xiàn)分析軟件，可以有效地獲取濾波一階微分曲線(xiàn)、鑒定熔解區(qū)域、熒光性與正常曲線(xiàn)間差集等。CELINE等[23]運(yùn)用HRM技術(shù)對(duì)21個(gè)SNP位點(diǎn)基因分型，實(shí)現(xiàn)快速、有效地識(shí)別樣品種類(lèi)，并在新一代測(cè)序中追蹤樣品，滿(mǎn)足現(xiàn)代分子遺傳學(xué)試驗(yàn)中完整干態(tài)、濕態(tài)實(shí)驗(yàn)室研究的需求。

2.2 高自動(dòng)化分型方法

2.2.1 侵入檢測(cè)法

侵入檢測(cè)法的原理是等位基因特異性初始探針的一個(gè)5’端的擺動(dòng)序列不與目的DNA互補(bǔ)結(jié)合[24]。侵入探針的3’端可以通過(guò)SNP位點(diǎn)的堿基特異性形成重疊區(qū)，再用核酸內(nèi)切酶I識(shí)別切斷，釋放目標(biāo)特異性產(chǎn)物，然后通過(guò)裂解酶裂解5’端擺動(dòng)序列形成折疊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而從淬滅熒光基團(tuán)中釋放報(bào)告熒光基團(tuán)，發(fā)射熒光，以此來(lái)追蹤報(bào)告SNPs。侵入檢測(cè)法可通過(guò)微量樣本檢測(cè)SNP突變情況，易于自動(dòng)化操作，侵入檢測(cè)原理見(jiàn)圖1。

圖1 侵入檢測(cè)原理圖Fig.1 Principle of intrusion detection

2.2.2 焦磷酸測(cè)序法

焦磷酸測(cè)序技術(shù)[25]是依托PCR擴(kuò)增模板單鏈與引物雜交，在多種酶作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)模板遺傳信息的分析。模板與dNTP互補(bǔ)配對(duì)，并通過(guò)DNA聚合酶延伸，釋放焦磷酸基團(tuán)，焦磷酸基團(tuán)在三磷腺苷硫酸化酶的酶促作用下與5’-磷酸化硫酸腺苷生成ATP，然后熒光素酶使得ATP與熒光素發(fā)生作用，可根據(jù)dNTP種類(lèi)和熒光強(qiáng)弱來(lái)跟蹤記錄模板序列。王文基[26]使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis組織測(cè)序，得到75萬(wàn)個(gè)序列。曾地剛等[27]運(yùn)用焦磷酸測(cè)序法對(duì)凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei的CTLS序列編號(hào)為C681G的SNP位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)C/C、C/G和G/G基因型以及基因型頻率符合哈-溫平衡，且在群體中該SNP位點(diǎn)與體重不顯著。CRISTIAN等[28]運(yùn)用454焦磷酸測(cè)序法對(duì)蛤蜊Mesodesma donacium進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2 594個(gè)與613共有序列相關(guān)的SNP位點(diǎn)，平均每260 bp就有一個(gè)SNP位點(diǎn)，A/G、A/T以及C/T多態(tài)性較為豐富，通過(guò)熱休克蛋白-70及翻譯延長(zhǎng)因子1-a注解基因驗(yàn)證了12個(gè)SNP位點(diǎn)軌跡。焦磷酸測(cè)序法精確度高、重復(fù)性好、無(wú)需熒光標(biāo)記、電泳等，可配合高通量測(cè)序儀器準(zhǔn)確、直接測(cè)定序列，特別適用于短至中等長(zhǎng)度序列。

2.2.3 微珠芯片技術(shù)（GoldenGate）

微珠芯片技術(shù)是通過(guò)寡核苷酸對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，經(jīng)過(guò)延伸、連接作用，形成等位基因特異性模板芯片，再運(yùn)用微珠陣列閱讀程序?qū)π酒蠠晒庑盘?hào)進(jìn)行掃描分析，自動(dòng)對(duì)基因型聚類(lèi)分析[29]。目前較為先進(jìn)的iSelect Infinium Custom Genotyping檢測(cè)系統(tǒng)可以同時(shí)測(cè)定千萬(wàn)個(gè)基因型，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[30-34]、作物基因組學(xué)[35-39]，這為水產(chǎn)動(dòng)物基因組學(xué)研究提供參考。LAPEGUE等[40]通過(guò)電腦模擬及GoldenGate基因分型對(duì)太平洋牡蠣Crassostrea gigas和歐洲平牡蠣Ostrea edulis SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究，利用Illumina公司GoldenGate陣列技術(shù)為兩種牡蠣設(shè)計(jì)兩套384個(gè)SNP標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)每種牡蠣基因型SNP位點(diǎn)多態(tài)性比率約60%，并通過(guò)仿真模擬，發(fā)現(xiàn)至少有150個(gè)標(biāo)記需要完成精確的親本分配，可有效地研究野生群體與人工選擇群體間的連通性及牡蠣的選擇性育種。常見(jiàn)的高通量分型技術(shù)還有基因芯片[41]、TaqMan技術(shù)[42]、MALDI-TOF[43]等，因價(jià)格昂貴等因素，尚未發(fā)現(xiàn)在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)中應(yīng)用。

3 SNP標(biāo)記在遺傳學(xué)中的應(yīng)用

3.1 基因定位與遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

構(gòu)建遺傳圖譜可以顯示所知基因或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物QTL進(jìn)行精準(zhǔn)定位，有利于基因克隆研究的開(kāi)展。張建勇[44]設(shè)計(jì)800組SNP引物，篩選出200組構(gòu)建中國(guó)對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis親本遺傳連鎖圖譜，包含16個(gè)連鎖群、180個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)度899.3cM，覆蓋率分別為51.94%和53.77%，依據(jù)圖譜檢驗(yàn)中國(guó)對(duì)蝦體重、體長(zhǎng)性狀連鎖顯著性，發(fā)現(xiàn)了C2 904-168、C1 2871-235兩個(gè)與體重相關(guān)的SNP位點(diǎn)。張振[45]利用SSR、SNP分子標(biāo)記技術(shù)成功對(duì)皺紋盤(pán)鮑Haliotis discus hannai2個(gè)家系作圖構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，覆蓋了18個(gè)連鎖群，連鎖群中分子標(biāo)記均數(shù)約為18.0，平均間隔2.65 cM，圖譜總長(zhǎng)度810.32cM，覆蓋率88.8%。HSIN等[46]運(yùn)用“ssalar01”高密度SNP矩陣對(duì)60組核心家系622條大西洋鮭魚(yú)Salmo salar進(jìn)行基因分型并構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜，圖譜包含超過(guò)96 K的SNP位點(diǎn)和29組鮭魚(yú)連鎖群體，每組SNP位點(diǎn)與染色體長(zhǎng)度（r=0.95）呈顯著正相關(guān)。盡管遺傳與物理圖譜標(biāo)記規(guī)則大體一致，但仍存在差異區(qū)域，覆蓋率增加了6.5%，雄性重組率低于雌性，在端粒區(qū)有明顯峰值。LI等[47]通過(guò)250 K SNP陣列構(gòu)建斑點(diǎn)叉尾鮰Ietalurus Punetaus高密度、高分辨率遺傳圖譜，包含了54 342個(gè)SNP位點(diǎn)，總長(zhǎng)度2505.4 cM，雌性與雄性重組率為1.7:1，覆蓋率為90%。AO等[48]運(yùn)用限制酶位點(diǎn)DNA測(cè)序（RAD-seq）技術(shù)發(fā)現(xiàn)31 191個(gè)SNP位點(diǎn)均勻分布在大黃魚(yú)Larimichthys crocea基因組上，其中有10 150個(gè)SNP位點(diǎn)分屬于24個(gè)共識(shí)連鎖群體，遺傳圖譜總長(zhǎng)度5451.3 cM，位點(diǎn)間距0.54 cM，并利用大黃魚(yú)遺傳圖譜對(duì)棘魚(yú)Gasterosteus aculeatus和青鳉Oryzias latipes基因組同線(xiàn)性分析，發(fā)現(xiàn)大黃魚(yú)同棘魚(yú)的親緣關(guān)系近于青鳉。同時(shí)，在大黃魚(yú)24個(gè)染色體上標(biāo)記出1 274個(gè)免疫力相關(guān)基因和195個(gè)缺氧相關(guān)基因。目前，有很大一部分水產(chǎn)生物的第一代、第二代遺傳圖譜因標(biāo)記密度較低而難以進(jìn)行精細(xì)QTL分析，通過(guò)SNP技術(shù)可以有效地解決相關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳連鎖圖譜上標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量不足等現(xiàn)狀，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)研究具有重要的意義。

3.2 基因連鎖不平衡、關(guān)聯(lián)分析

基因連鎖是基于兩等位基因在同一染色體上存在幾率大于隨機(jī)分布同時(shí)存在的幾率，檢測(cè)分析水產(chǎn)生物基因組中的序列與性狀位點(diǎn)關(guān)系，便于新基因定位與克隆[49]。關(guān)聯(lián)分析一般是在連鎖不平衡基礎(chǔ)上，通過(guò)SNP標(biāo)記將目的基因與目的性狀相互關(guān)聯(lián)。邱櫻[50]基于7個(gè)EST-SNP位點(diǎn)對(duì)馬氏珠母貝Pinctada martensii兩個(gè)野生群體以及引進(jìn)群體進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)位點(diǎn)均包含兩個(gè)等位基因，并將其中3個(gè)位點(diǎn)在子三代中擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)基因型比符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，可以作為馬氏珠母貝群體遺傳學(xué)分析位點(diǎn)。曹婷婷[51]通過(guò)線(xiàn)性模型對(duì)草魚(yú)Ctenopharyngodon idellus的2個(gè)SNP位點(diǎn)和質(zhì)量、體長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)個(gè)別位點(diǎn)不同基因型個(gè)體的質(zhì)量均值差異顯著，AA基因型各項(xiàng)指標(biāo)均值顯著高于CC型，草魚(yú)的CPA1基因可作為草魚(yú)分子輔助育種的候選基因。ZHANG等[52]利用SNP標(biāo)記分析團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala低氧功能基因fih-1，發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴氨基酸序列顯示同其他脊椎動(dòng)物同源性很高，結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域高度保守，其不同組織和發(fā)展階段的mRNA水平曲線(xiàn)表明團(tuán)頭魴fih-1基因在肝臟和肌肉中表達(dá)程度很高，其次是腮、腸、脾臟。團(tuán)頭魴fih-1 mRNA在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)程度較高，然后會(huì)下降至較低水平，在孵化后又會(huì)保持在相對(duì)高水平的狀態(tài)。GUTIERREZ等[53]通過(guò)4.5K SNP陣列對(duì)480個(gè)大西洋鮭魚(yú)Salmo salar進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)早熟幼鮭Ssa10、Ssa02、Ssa13、Ssa25、Ssa12位點(diǎn)標(biāo)記和晚熟幼鮭Ssa28、Ssa01、Ssa21位點(diǎn)處標(biāo)記關(guān)聯(lián)顯著，Ssa13位點(diǎn)處生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)性水平較低，與基因標(biāo)記相關(guān)的候選位點(diǎn)可以反映性成熟發(fā)育歷程的直屬關(guān)系，在大西洋鮭魚(yú)育種應(yīng)用中的生長(zhǎng)相關(guān)標(biāo)記檢測(cè)需要運(yùn)用高密度SNP克服較低水平的連鎖不平衡。FU等[54]分析了羅非魚(yú)Oreochromis sppcDNA肥大細(xì)胞蛋白酶8（MCP8）及其基因組結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MCP-8基因在脾臟中表達(dá)高，在肝臟、血液、大腦、鰓、腸、皮膚中次之，在腎臟、肌肉和眼表達(dá)水平較低，且在MCP-8基因序列中發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs，其中有三個(gè)位點(diǎn)對(duì)無(wú)乳鏈球菌抗性顯著。水產(chǎn)動(dòng)物抗性性狀基因定位及關(guān)聯(lián)分析是水產(chǎn)動(dòng)物分子育種研究的重要內(nèi)容，其主要限制因素是缺少足夠的標(biāo)記，而SNP分布密度廣、幾乎遍布整個(gè)基因組，在全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中優(yōu)于其他分子標(biāo)記技術(shù)，且一個(gè)染色體區(qū)域一般僅有幾個(gè)常見(jiàn)的SNP單體型，但其代表大部分的多態(tài)性，僅需少數(shù)SNP標(biāo)簽即可實(shí)現(xiàn)基因組選擇、遺傳以及育種過(guò)程中對(duì)目的基因的跟蹤[55]。

3.3 遺傳多樣性分析

SNP可通過(guò)對(duì)不同群體比較，獲得不同地理群體遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有效地分析該物種的遺傳多樣性，為水產(chǎn)動(dòng)物分子輔助育種提供參考。金玉琳[56]通過(guò)HRM分析55個(gè)SNP位點(diǎn)在六個(gè)長(zhǎng)牡蠣Crassostreagigas家系中的遺傳模式，發(fā)現(xiàn)其中的48個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)過(guò)多態(tài)性，沒(méi)有無(wú)效等位基因，呈遺傳分離現(xiàn)象，且家系SNP多態(tài)性的鑒定成功率與親本數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。于凌云等[57]基于草魚(yú)Cteaophoyngodon idellus0 EST數(shù)據(jù)庫(kù)中21個(gè)SNPs分析長(zhǎng)江、珠江水系6個(gè)地理群體遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)監(jiān)利群體PIC、Ne、He最高，沅江群體最低，并對(duì)遺傳距離聚類(lèi)分析，確立了長(zhǎng)江與珠江部分群體的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系。江麗華[58]運(yùn)用SNP技術(shù)對(duì)舟山、漳浦、澄邁以及寧德四個(gè)地理種群的大黃魚(yú)Pseudosciaena crocea進(jìn)行遺傳背景分析，獲得57組良好分型位點(diǎn)以及10個(gè)基因型，其中AT、GC為稀有突變型，可以在大黃魚(yú)遺傳多樣性以及種群結(jié)構(gòu)分析中利用。URTZI等[59]對(duì)取自26個(gè)地理位置共1 331個(gè)長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)Thunnus alalunga進(jìn)行SNP位點(diǎn)基因分型，發(fā)現(xiàn)過(guò)度捕撈影響著長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性。對(duì)地中海、大西洋、印度洋和太平洋的群體進(jìn)行基因水平上同質(zhì)群體界定，發(fā)現(xiàn)北大西洋長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)有效種群大小沒(méi)有出現(xiàn)歷史性下降，其種群遺傳多樣性與進(jìn)化潛力沒(méi)有受到過(guò)度捕撈顯著影響。JOBRAN等[60]對(duì)加拿大小奴湖的白鮭魚(yú)Coregonus clupeaformis群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了51個(gè)編碼基因區(qū)SNP位點(diǎn)，且當(dāng)?shù)匕柞q魚(yú)系單一遺傳繁殖群體，并通過(guò)基因掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個(gè)與生長(zhǎng)差異相關(guān)的二磷酸核苷激酶A編碼區(qū)SNP位點(diǎn)。KHRUSTALEVA等[61]對(duì)堪察加-白令區(qū)域的紅大麻哈魚(yú)Oncorhynchus nerka群體的45個(gè)SNP位點(diǎn)的可變性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)島嶼與大陸的紅大麻哈魚(yú)群體存在相當(dāng)大的差異，當(dāng)?shù)丨h(huán)境壓力很大程度上決定著紅大麻哈魚(yú)單核苷酸堿基替換頻率，部分區(qū)域群體出現(xiàn)較高的遺傳分化。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，表型性狀數(shù)量有限，難以滿(mǎn)足多樣性研究需求，故而需要從分子水平上分析物種遺傳多樣性。處于非編碼區(qū)的SNP在進(jìn)化上屬于中性，沒(méi)有選擇壓力，其保守程度低于編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)，在群體中的豐度是遺傳漂變結(jié)果[62]，有利于對(duì)種群遺傳多樣性進(jìn)行綜合評(píng)估。

表2 SNP在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)中應(yīng)用Tab.2 Applications of SNP in aquatic animal genetics

4 展望

SNP的發(fā)現(xiàn)方法、分型手段多種多樣，水產(chǎn)動(dòng)物一般無(wú)需全基因組測(cè)序，主要還是通過(guò)EST、目標(biāo)特異性PCR、簡(jiǎn)化RSS以及BAC末端序列數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)獲取，分型方式可由成本、自動(dòng)化程度、標(biāo)記數(shù)量、樣品量以及可靠性等而定，具體選擇哪種研究方法取決于研究目標(biāo)與研究條件，水產(chǎn)動(dòng)物樣品量一般相對(duì)較小，目前多采用HRM、焦磷酸測(cè)序等分型手段。

針對(duì)目前的研究狀況，SNP研究重點(diǎn)應(yīng)側(cè)重于以下幾個(gè)方面：①?lài)?guó)內(nèi)SNP技術(shù)研究多集中于應(yīng)用方面，在SNP技術(shù)的檢測(cè)、分型方法、成本以及技術(shù)革新等方面的研究力度還有待于加強(qiáng)。②目前，DNA微陣列與芯片技術(shù)的應(yīng)用大大提高了SNP檢測(cè)分型的精確度，但仍沒(méi)有研發(fā)出同時(shí)符合高通量、高精度、低成本的理想檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)高效的分析系統(tǒng)、構(gòu)建基因分型技術(shù)平臺(tái)將是SNP技術(shù)的研究重點(diǎn)。③與第一、二代分子技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物基因組學(xué)研究以及SNP在醫(yī)療、作物等方面的應(yīng)用相比較，SNP在水產(chǎn)動(dòng)物上的研究與應(yīng)用水平并不高，但隨著獲得越來(lái)越多的水產(chǎn)動(dòng)物序列信息，繪制包含大量SNP標(biāo)記的遺傳圖譜，通過(guò)QTL基因組掃描等技術(shù)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行功能相關(guān)分析，將能夠更好地集中于水產(chǎn)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀以及生物學(xué)發(fā)面的研究，高效地推動(dòng)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種發(fā)展。

[1]楊昭慶,洪坤學(xué).單核苷酸多態(tài)性的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊(cè),2000,23(1):4-8.

[2]LANDER E S.The new genomics:global views of biology[J].Science,1996,274(5287):536-539.

[3](美)劉占江.Aquaculture Genome Technologies[M].鮑寶龍,譯.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011:33-34.

[4]MIDDLETON F A,PATO M T,GENTILE K L,et al.Genomewide linkage analysis of bipolar disorder by use of a high-density single-nucleotide-polymorphism(SNP)genotyping assay:a comparison with microsatellite marker assays and finding of significant linkage to chromosome 6q22[J].Am J Hum Genet,2004,74(5):886-897.

[5]JOHN S,SHEPHARD N,LIU G,et al.Whole-genome scan,in a complex disease,using 11245 single-nucleotide polymorphisms:comparison with microsatellites[J].Am J Hum Genet,2004,75(1):54-64.

[6]LIN H F,JU O S H,CHENG R.Comparison of the power between microsatellite and single-nucleotide polymorphism markers for linkage and linkage disequilibrium mapping of an electrophysiological phenotype[J].BMC Genet,2005,6(Suppl 1):S7.

[7]MA Q,YU Y,MENG Y,et al.Genome-wide linkage analysis for alcohol dependence:a comparison between single-nucleotide polymorphism and microsatellite marker assays[J].BMC Genet,2005,6(Suppl 1):S8.

[8]KIM H,HUTTER C M,MONKS S A,et al.Comparison of single-nucleotide polymorphisms and microsatellites in detecting quantitative trait loci for alcoholism:the Collaborative Study on the Genetics of Alcoholism[J].BMC Genet,2005,6(Suppl 1):S5.

[9]WILCOX M A,PUGH E W,ZHANG H,et al.Comparison of single-nucleotide polymorphisms and microsatellite markers for linkage analysis in the COGA and simulated data sets for Genetic Analysis Workshop 14:Presentation Groups 1,2,and 3[J]. Genet Epidemiol,2005,29(Suppl 1):S7-S28.

[10]BENILTON C,RAFAEL A I,ROBERT B S,et al.Processing and analyzing affumetrix SNP chip with bioconductor[J].Statistics in Biosciences,2009,1(2):160-180.

[11]許家磊,王 宇,后 猛,等.SNP檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].分子植物育種,2015,13(2):475-482.

[12]DE WIT P.SNP Discovery through Next-Generation Sequencing and Its Applications[J].Methods Mol Biol,2016,1452:81-95.

[13]唐一通,肖 娜,李智山,等.單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)發(fā)展,2013,13(27):5 393-5 396.

[14]邢賀飛.半滑舌鰨抗病相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選及兩種免疫相關(guān)基因的克隆與初步分析[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2015.

[15]GONEN D,VEENSTRA-VANDERWEELE J,YANG Z,et al.High throughput fluorescent CE-SSCP SNP genotyping[J].Mol Psychiatry,1999,4(4):339-343.

[16]李玉梅,姚紀(jì)元,吳 靜,等.PCR-SSCP技術(shù)的研究及應(yīng)用發(fā)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2007(6):71-74.

[17]馬瑞芹.牙鲆三種細(xì)胞色素P450酶基因SNP與大致內(nèi)分泌相關(guān)性分析[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2012.

[18]ZHANG X H,XU S Z,GAO X,et al.The application of asymmetric PCR-SSCP in gene mutation detecting[J].Frontiers of A-griculture in China,2008,2(3):361-364.

[19]WITTWER C T,REED G H,GUNDRY C N,et al.High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen[J].Clin Chem,2003,49(6 Pt 1):853-860.

[20]逄錦菲.中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)“黃海2號(hào)”人工感染W(wǎng)SSV的熒光定量分析[D].上海:上海海洋大學(xué),2013.

[21]SEEB J E,PASCAL C E,GRAU E D,et al.Transcriptome sequencing and high-resolution melt analysis advance single nucleotide polymorphism discovery in duplicated salmonid[J].MolEcolRes,2011,11(2):335-348.

[22]LI H Z,LAN R T,PENG N C,et al.High resolution melting curve analysis with MATLAB-based program[J].Measurement, 2016,90:178-186.

[23]CELINE H,R.FRANK K,GEERT V.Multiplexed high resolution melting assay for versatile sample tracking in a diagnostic and research setting[J].J Mol Diagn,2016,18(1):32-38.

[24]HSU T M,LAW S M,DUAN S,et al.Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection[J].Clin Chem,2001,47(8):1 373-1 377.

[25]HE C,CHEN L,SIMMONS M,et al.Putative SNP discovery in interspecific hybrids of catfish by comparative EST analysis[J]. Anim Genet,2003,34(6):445-448.

[26]王文基.半滑舌鰨和牙鲆的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及初步分析[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2014.

[27]曾地剛,陳秀荔,謝達(dá)祥,等.基于高通量測(cè)序的凡納濱對(duì)蝦的轉(zhuǎn)錄組分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2013,32(3):308-313.

[28]CRISTIAN G,VALENTINA V,GUSTAVO N,et al.SNP discovery and gene annotation in the surf clam Mesodesma donacium [J].Aquaculture Research,2015,46(5):1 175-1 187.

[29]FAN J B,OLIPHANT A,SHEN R,et al.Highly parallel SNP genotyping[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2003,68: 69-78.

[30]SUSAN E S,ANNA W,SAMUEL ANTWI,et al.SNPs in vitamin D-related genes are associated with prostate cancer aggressiveness in the North Carolina-Louisiana Prostate Cancer Project(PCaP)[J].Cancer Research,2016,76(14):806.

[31]EOM S Y,YIM D H,LEE C H,et al.Interactions between paraoxonase 1 genetic polymorphisms and smoking and their effects on oxidative stress and lung cancer risk in a Korean population[J].PLoS One,2015,10(3):e0119100.

[32]SHIMOSAKO N,KERR J R.Use of single-nucleotide polymorphisms(SNPs)to distinguish gene expression subtypes of chronic fatigue syndrome/myalgic encephalomyelitis(CFS/ME)[J].J Clin Pathol,2014,67(12):1 078-1 083.

[33]ARUN N,ICELA P,GANDHI P,et al.Association of TRPM3 Polymorphism(rs10780946)and Aspirin-Exacerbated Respiratory Disease(AERD)[J].Lung,2016,194(2):273-279.

[34]GUJARIA-VERMA N,RAMSAY L,SHARPE AG,et al.Gene-based SNP discovery in tepary bean(Phaseolus acutifolius)and common bean(P.vulgaris)for diversity analysis and comparative mapping[J].BMC Genomics,2016,17:239.

[35]LEE J S,YOO M H,JUNG J K,et al.Detection of novel QTLs for foxglove aphid resistance in soybean[J].Theor Appl Genet, 2015,128(8):1 481-1 488.

[36]TEA K,A INKERI L,HANNA P,et al.Preeclampsia does not share common risk alleles in 9p21 with coronary artery disease and type 2 diabetes[J].Annals of Medicine,2016:1-7.

[37]YAN J B,YANG X H,TRUSHAR S,et al.High-throughput SNP genotyping with the GoldenGate assay in maize[J].Molecular Breeding,2010,25(3):441-451.

[38]YU R B,YAN W,LIANG M Z,et al.Exploring the genetic characteristics of 93-11 and Nipponbare recombination inbred lines based on the GoldenGate SNP assay[J].Science China Life Sciences,2016,59(7):700-708.

[39]KHAN M A,HAN Y P,ZHAO Y F,et al.A high-throughput apple SNP genotyping platform using the GoldenGateTMassay[J]. Gene-COMBIS,2012,494(2):196-201.

[40]LAPEGUE S,HARRANG E,HEURTEBISE S,et al.Development of SNP-genotyping arrays in two shellfish species[J].Mol Ecol Resour,2014,14(4):820-830.

[41]HACIA J G,FAN J B,RYDER O,et al.Determination of ancestral alleles for human single-nucleotide polymorphisms using high-density oligonucleotide arrays[J].Nat Genet,1999,22(2):164-167.

[42]LI B,KADURA I,FU D J,et al.Genotyping with TaqMAMA[J].Genomics,2004,83(2):311-320.

[43]STORM N,DARNHOFER-PATEL B,VAN DEN BOOM D,et al.MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping[J]. Methods Mol Biol,2003,212:241-262.

[44]張建勇.中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）基因組SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2011.

[45]張 振.基于微衛(wèi)星和SNP標(biāo)記的皺紋盤(pán)鮑遺傳連鎖圖譜及其應(yīng)用[D].北京:中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所),2010.

[46]HSIN Y T,DIEGO R,NATALIE R L,et al.Construction and Annotation of a High Density SNP Linkage Map of the Atlantic Salmon(Salmo salar)Genome[J].G3-Genes Genomes Genetics,2016,6(7):2 173-2 179.

[47]LI Y,LIU S,QIN Z,et al.Construction of a high-density,high-resolution genetic map and its integration with BAC-based physical map in channel catfish[J].DNA Research,2015,22(1):39-52.

[48]AO J,LI J,YOU X,et al.Construction of the High-Density Genetic Linkage Map and Chromosome Map of Large Yellow Croaker(Larimichthys crocea)[J].Int J Mol Sci,2015,16(11):26 237-26 248.

[49]PRITCHARD J K,PRZEORSKI M.Linkage disequilibrium in humans:models and data[J].The American Journal of Human Genetics,2001,69(1):1-14.

[50]邱 櫻.馬氏珠母貝EST-SSR和SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其與生長(zhǎng)及珍珠層性狀的關(guān)聯(lián)分析[D].?？?海南大學(xué),2013.

[51]曹婷婷.草魚(yú)生長(zhǎng)相關(guān)SNPs的篩選和群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析[D].上海:上海海洋大學(xué),2012.

[52]ZHANG B,CHEN N,HUANG C,et al.Molecular response and association analysis of Megalobrama amblycephala fih-1 with hypoxia[J].Mol Genet Genomics,2016,291(4):1 615-1 624.

[53]GUTIERREZ A P,YANEZ J M,FUKUI S,et al.Genome-wide association study(GWAS)for growth rate and age at sexual maturation in Atlantic salmon(Salmo salar)[J].PLoS One,2015,10(3):e0119730.

[54]FU G H,WAN Z Y,XIA J H,et al.The MCP-8 gene and its possible association with resistance to Streptococcus agalactiae in tilapia[J].Fish Shellfish Immunol,2014,40(1):331-336.

[55]COWLING W A,BALAZS E.Prospects and challenges for genome-wide association and genomic selection in oilseed Brassica species[J].Genome,2010,53(11):1 024-1 028.

[56]金玉琳.長(zhǎng)牡蠣SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其在家系分析和物種鑒定中的應(yīng)用[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2014.

[57]于凌云,白俊杰,曹婷婷,等.六個(gè)不同地域草魚(yú)群體遺傳多樣性和遺傳距離的EST-SNP標(biāo)記分析 [A].中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C].2013.

[58]江麗華.我國(guó)主要石首魚(yú)科魚(yú)類(lèi)分子系統(tǒng)發(fā)育及大黃魚(yú)群體遺傳結(jié)構(gòu)的DNA標(biāo)記研究[D].廈門(mén):廈門(mén)大學(xué),2014.

[59]URTZI L,MIKEL I,HARITZ A,et al.New Nuclear SNP Markers Unravel the Genetic Structure and Effective Population Size of Albacore Tuna(Thunnus alalunga)[J].PLoS One,2015,10(6):e0128247.

[60]JOBRAN C,SEBASTIEN R,LOUIS B,et al.Genetic structure and within-generation genome scan analysis of fisheries-induced evolution in a Lake Whitefish(Coregonus clupeaformis)population[J].Conservation Genetics,2016,17(2):473-483.

[61]KHRUSTALEVA A M,KLOVACH N V,VEDISCHEVA E V,et al.Genetic Differentiation of Sockeye Salmon Oncorhynchus nerka from Kamchatka River Basin and the Lake-River Systems of the West Coast of the Bering Sea as Inferred from Data on Single Nucleotide Polymorphism[J].Genetika,2015,51(10):1 141-1 153.

[62]EDWARDS D,FORSTER J W,CHANGNE D,et al.What are SNPs[A]//ORAGUZIE N C,RIKKERINK E H A,GARDINER S E,et al.Association mapping in plants[M].NewYork:Springer,2007:41-52.

[63]張留所.凡納濱對(duì)蝦分子標(biāo)記篩選、連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位[D].北京:中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所),2006.

[64]唐劉秀.中華絨螯蟹育種群體遺傳特征分析及性早熟相關(guān)SNP標(biāo)記篩選[D].南京:南京師范大學(xué),2014.

[65]FU B,LIU H,YU X,et al.A high-density genetic map and growth related QTL mapping in bighead carp(Hypophthalmichthys nobilis)[J].Sci Rep,2016,6:28 679.

[66]吳 廉.中華絨螯蟹配套系育種群體的遺傳與性別效應(yīng)分析[D].上海:上海海洋大學(xué),2015.

[67]張德寧,呂建建,劉 萍,等.三疣梭子蟹生長(zhǎng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的鑒定[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2015,22(3):393-401.

[68]李喜蓮,楊元杰,李 飛,等.日本沼蝦EST-SNP的篩選及多態(tài)性檢測(cè)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(2):67-73.

[69]張 超,張海琪,許曉軍,等.中華鱉(Pelodiscus sinensis)不同品系線(xiàn)粒體SNP的分型與鑒定[J].海洋與湖沼,2014,45(2): 376-381.

[70]封利穎.蝦夷扇貝IGFBP5、IGF2BP2基因克隆、表達(dá)分析及與生長(zhǎng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)篩查[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2013.

[71]CREELMAN E K,HAUSER L,SIMMONS R K,et al.Temporal and Geographic Genetic Divergence:Characterizing Sockeye Salmon Populations in the Chignik Watershed,Alaska,Using Single-Nucleotide Polymorphisms[J].Transactions of the American Fisheries Society,2011,140(3):749-762.

Single Nucleotide Polymorphism and Its Application in Aquatic Animal Genetics

BIAN Guang-ming,HU Ze-hui,CHAI Xue-jun,et al
(Institute of Marine and Fisheries of Zhejiang Ocean University,Marine Fishery Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China)

Single nucleotide polymorphism(SNP),as the latest generation molecular marker,has many characters with widely spread and automated detection.It could be used in the aquatic animal genetics.This paper summarized the characteristics,application of main detection methods of SNP,the advantage and disadvantage of genotyping inrecent researchesfor aquatic animals.latestly,the prospect of SNP molecular marker was also predicted.

SNP;aquatic animals;genotyping;application

S 917

A

1008-830X(2016)04-0346-08

2016-05-10

浙江省科技廳合作與轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2013F50003）；浙江省科技廳公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2014C32069）；舟山市公益類(lèi)科技項(xiàng)目（2014C31062）；舟山市公益項(xiàng)目（2015C31013）

卞光明（1992-），男，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：種質(zhì)與種苗工程.E-mail:mingbg@163.com

柴學(xué)軍（1972-），男，浙江舟山人，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：魚(yú)類(lèi)繁育與海洋生物技術(shù).E-mail:chaixj6530@sohu.com