韓 璐， 修景潤(rùn)， 代 月， 廉美蘭， 尹光浩， 金美玉*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 龍井 133400;3.延邊州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,吉林 延吉 133000)

幾種因素對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

韓 璐1， 修景潤(rùn)2， 代 月2， 廉美蘭1， 尹光浩3， 金美玉1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 龍井 133400;3.延邊州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,吉林 延吉 133000)

為尋找一種簡(jiǎn)單、低成本及可規(guī)?；a(chǎn)模式，以白鶴芋組培苗單株(2 cm)為外植體，研究不同培養(yǎng)方法、接種量、通氣量和糖種類對(duì)白鶴芋組培苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：利用接觸式生物反應(yīng)器培養(yǎng)，有利于白鶴芋叢生芽增殖，組培苗葉色濃綠，鮮重和干重高于其它處理。同時(shí)，在接種量60個(gè)單株、通氣量為0.3 vvm的處理中達(dá)到最佳效果。為大規(guī)模培養(yǎng)節(jié)約成本，糖種類選擇了白糖。

白鶴芋；組培苗；接種量；通氣量；生物反應(yīng)器

白鶴芋(Spathiphyllumfloribundum)，又名白掌、包葉芋、一帆風(fēng)順，屬天南星科(Araceae)、白鶴芋屬多年生草本植物，原產(chǎn)熱帶美洲，其中許多種或雜交種是重要熱帶花卉[1]。其葉片翠綠，花色潔白，非常清新優(yōu)雅，可以過濾室內(nèi)廢氣，是世界重要的觀賞花[2]。20世紀(jì)初應(yīng)用于盆栽觀賞，到80年代歐洲已十分流行。白鶴芋組織培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)70年代末[3-4]，主要利用芽的外植體獲得叢生芽，增殖后生根培養(yǎng)并獲得大量植株，其主要目的是滿足育種和生產(chǎn)上的需求?？焖俜敝嘲Q芋的有效途徑是進(jìn)行組織培養(yǎng)，已有的報(bào)道中用白鶴芋的莖段，莖尖，葉片和頂芽為外植體都有成功的先例[5-7]。

白鶴芋屬植物因花粉退化，正常條件下不結(jié)籽，主要為無性繁殖，但繁殖系數(shù)低、速度慢，不能滿足市場(chǎng)需求。組織培養(yǎng)可以將繁殖系數(shù)提高幾十倍，加速良種繁育速度，目前，利用組織培養(yǎng)對(duì)白鶴芋進(jìn)行快速繁殖的報(bào)道雖有一些，但其結(jié)果因其品種不同，仍然存在許多差異[8]。因此，本研究旨在建立一個(gè)全新的試驗(yàn)體系，利用生物反應(yīng)器進(jìn)行液體培養(yǎng)，研究白鶴芋組培苗增殖的最佳條件，使白鶴芋組培苗的增殖系數(shù)更高，彌補(bǔ)固體培養(yǎng)操作繁瑣、成本高、周期長(zhǎng)的問題，為今后運(yùn)用生物反應(yīng)器進(jìn)行增殖培養(yǎng)和實(shí)現(xiàn)白鶴芋組培苗壯苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為白鶴芋組培苗，從韓國忠北大學(xué)引進(jìn)，培養(yǎng)在 MS[9]固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

生物反應(yīng)器為本實(shí)驗(yàn)室自行研制的氣球型氣升式生物反應(yīng)器(3 L)，培養(yǎng)基為MS液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)方法對(duì)白鶴芋生長(zhǎng)的影響

利用3 L氣升式球形生物反應(yīng)器分別進(jìn)行接觸培養(yǎng)及間歇浸沒培養(yǎng)，以傳統(tǒng)組培的固體培養(yǎng)作為對(duì)照。

1) 生物反應(yīng)器培養(yǎng) 在生物反應(yīng)器離底部10 cm處架一支持網(wǎng)，使接種的每個(gè)外植體單株在支持網(wǎng)上生長(zhǎng)。每個(gè)反應(yīng)器均加入MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L(pH值5.8)的培養(yǎng)基2.0 L，接入50個(gè)單株，培養(yǎng)基中通入0.20 vvm(air volume/culture volume/min)的氣體，每個(gè)處理接種3個(gè)反應(yīng)器作為重復(fù)。

2) 間歇浸沒式培養(yǎng) 1 h供應(yīng)1次培養(yǎng)基，每天供應(yīng)12次。

3) 接觸式培養(yǎng) 為確保外植體在生物反應(yīng)器的支持網(wǎng)上始終與培養(yǎng)基接觸，根據(jù)培養(yǎng)基消耗情況，定期補(bǔ)充培養(yǎng)基。

4) 固體培養(yǎng) 在200 mL的PC瓶中，加入25 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+瓊脂粉8.0 g/L(山東濟(jì)南普朗特生物科技有限公司)，pH值調(diào)節(jié)為5.8。每瓶接入2個(gè)單株，每組處理10瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度1 600 lx，每天光照16 h，40 d后調(diào)查株高、叢生芽數(shù)、鮮物重和干物重。

1.2.2 接種量對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

在3 L氣升式氣球型生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行接觸式培養(yǎng)。接種量設(shè)置為每個(gè)反應(yīng)器接入40、50、60和70個(gè)單株，培養(yǎng)基通氣量調(diào)節(jié)為0.20 vvm，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)條件及調(diào)查方法同1.2.1。

1.2.3 通氣量對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

3 L反應(yīng)器內(nèi)(含2 L培養(yǎng)基)接入60個(gè)單株的白鶴芋組培苗(2 cm)進(jìn)行接觸式培養(yǎng)，通氣量調(diào)節(jié)為0.1、0.2、0.3、0.4 vvm，培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式同1.2.2，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)條件及調(diào)查方法同上1.2.2。

1.2.4 碳源對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

在含有2 L培養(yǎng)液的3 L反應(yīng)器里，通入的空氣量調(diào)節(jié)為0.30 vvm，白鶴芋組培苗的接種量為60個(gè)植株，取30 g/L的白糖和蔗糖分別加入MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，pH值調(diào)節(jié)為5.8，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)條件及調(diào)查方法同上1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

將白鶴芋組培苗分別進(jìn)行固體培養(yǎng)基培養(yǎng)、間歇式液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和接觸式液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別培養(yǎng)40 d后進(jìn)行白鶴芋組培苗增殖情況的調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接觸式生物反應(yīng)器中可生長(zhǎng)出大量的單株外植體叢生芽，而且生長(zhǎng)速度較快，狀態(tài)良好。

由表1可知，在接觸式生物反應(yīng)器中可生長(zhǎng)出大量的白鶴芋組培苗，獲得了株高6.41 cm、鮮物重40.90 g/L、干物重4.89 g/L和叢生芽數(shù)6.10，最多，間歇式生物反應(yīng)器培養(yǎng)次之，固體培養(yǎng)的增殖效果最差，三者的單個(gè)外植體再生形成的芽的平均數(shù)存在極顯著差異;在白鶴芋組培苗增殖過程中，反應(yīng)器中生長(zhǎng)的組培苗一直保持旺盛的增殖生長(zhǎng)，叢生芽數(shù)增加較為明顯，植株葉片顏色為鮮綠色，而固體培養(yǎng)白鶴芋組培苗增殖速度相對(duì)較慢，生長(zhǎng)狀況良好。

表1 培養(yǎng)方法對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

注：為0.05顯著水平的多重比較結(jié)果，下同。

2.2 接種量對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

將40、50、60和70 個(gè)單株白鶴芋組培苗接種于3 L氣升式氣球型生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)叢生芽在培養(yǎng)初期長(zhǎng)勢(shì)緩慢，經(jīng)15 d后，叢生芽分化和生長(zhǎng)速度明顯加快。

從表2可知，生長(zhǎng)40 d后，接種量為40個(gè)單株時(shí)，株高、叢生芽數(shù)、鮮物重和干物重明顯低于其它處理，接種量為60個(gè)單株時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)明顯優(yōu)于其它處理，株高6.29 cm，叢生芽數(shù)12，鮮物重65.25 g，干物重7.68 g。

表2 接種量對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

2.3 通氣量對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

反應(yīng)器內(nèi)通入適宜的氧氣有利于白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)。當(dāng)通氣量為0.3 vvm時(shí)，所培養(yǎng)的白鶴芋組培苗不僅生長(zhǎng)健壯，而且所有參數(shù)均顯著優(yōu)于其它處理，株高、鮮物重和干物重達(dá)到最高值，分別為4.87 cm、41.76 g/L和3.98 g/L(表3)。當(dāng)通氣量為0.1 vvm時(shí)，外植體的株高、鮮物重、干物重和叢生芽數(shù)等結(jié)果較差；通氣量為0.20和0.40 vvm處理中，組培苗顏色綠，葉片肥厚，但0.40 vvm處理中株高、叢生芽數(shù)、鮮物重和干物重等低于0.30 vvm處理。結(jié)果表明：通氣量為0.30 vvm最利于促進(jìn)白鶴芋組培苗增殖，過低或過高都不適宜。

表3 通氣量對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

2.4 碳源對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

糖是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的，它不但作為離體組織賴以生長(zhǎng)的碳源，而且還能維持培養(yǎng)基滲透壓。本試驗(yàn)調(diào)查了糖種類對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響。從表4可以看出，用蔗糖作為碳源時(shí)，株高、鮮物重和干物重略高于白糖處理，但差異不大，以白糖作為碳源處理時(shí)，獲得的叢生芽數(shù)明顯高于蔗糖。從外觀上看，2個(gè)處理對(duì)白鶴芋組培苗的生長(zhǎng)無明顯差異，表明蔗糖和白糖均適用于白鶴芋組織培養(yǎng)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，需糖量巨大，為節(jié)約成本，可利用白糖代替蔗糖作為有效糖源。

表4 糖種類對(duì)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的影響

注：**為0.05顯著水平的獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)是指通過無菌和人工控制的環(huán)境條件，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。其突出特點(diǎn)是生長(zhǎng)周期短、繁殖系數(shù)高、能夠保持原種苗的優(yōu)良性狀，同時(shí)培養(yǎng)條件可人為控制、管理方便、有利于工廠化生產(chǎn)。傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)有固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2種方式。固體培養(yǎng)最大的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，通氣問題易于解決，便于觀察研究，但外植體與培養(yǎng)基接觸面積小，養(yǎng)分在培養(yǎng)基中擴(kuò)散慢，影響吸收利用，培養(yǎng)物排出的代謝廢物對(duì)組織可產(chǎn)生毒害作用。本試驗(yàn)打破傳統(tǒng)固體培養(yǎng)模式，優(yōu)化為生物反應(yīng)器液體培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用接觸式生物反應(yīng)器，能夠大量擴(kuò)繁白鶴芋組培苗，節(jié)省了成本和操作時(shí)間，為大規(guī)模生產(chǎn)拓寬了思路。

在反應(yīng)器培養(yǎng)中，接種量的多少對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)影響很大，接種量低，既浪費(fèi)空間，又不利于植物生長(zhǎng)；而接種量過高時(shí)，營養(yǎng)成分和氧氣不能被充分利用，植物生長(zhǎng)受抑制，會(huì)加速植物的衰老死亡[10-11]。金美玉[12]，楊金鳳[13]研究發(fā)現(xiàn)，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)葡萄，接種量過高或過低，均不利于葡萄組培苗增殖生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，接種量為60個(gè)單株，最適于白鶴芋組培苗在3 L(含2 L培養(yǎng)液)的反應(yīng)器中培養(yǎng)。

在反應(yīng)器中提供外源氧氣，可以給植物代謝活動(dòng)提供充分的溶解氧，同時(shí)，可以充分?jǐn)噭?dòng)培養(yǎng)基，有利于培養(yǎng)物吸收營養(yǎng)成分[14]。金美玉[12]研究表明，通氣量0.15 vvm為葡萄生物反應(yīng)器培養(yǎng)的最佳通氣量。在本試驗(yàn)中，當(dāng)通氣量為0.3 vvm時(shí)，培養(yǎng)的白鶴芋組培苗不僅生長(zhǎng)健壯，而且所有參素均顯著優(yōu)于其它處理。株高、鮮物重和干物重?cái)?shù)達(dá)到最高值(4.87 cm、41.76 g/L和3.98 g/L)。

糖是植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素，至今為止，已有近50種糖類可用于植物組織培養(yǎng)，其中，蔗糖一直作為標(biāo)準(zhǔn)碳源，但許多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，其它糖類如葡萄糖、果糖、麥芽糖等對(duì)植物組織培養(yǎng)均有不同的良好表現(xiàn)[15]。糖濃度影響滲透壓和養(yǎng)分吸收，過高濃度的蔗糖可以產(chǎn)生較高含量的生物活性物質(zhì)[16]，這可能是由于高滲透壓影響了分解代謝從而導(dǎo)致碳代謝途徑發(fā)生變化[17]。在不同碳源對(duì)草原櫻桃增殖和生根培養(yǎng)的研究中，蔗糖和白砂糖差異不顯著，而白砂糖的市售價(jià)較低，因此在生產(chǎn)中可以用白砂糖替代蔗糖作為碳源，又能達(dá)到降低成本的目的[18]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，用蔗糖和白糖作為碳源，對(duì)白鶴芋在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)狀況無明顯差異，為節(jié)約成本，從投入成本及外植體叢生芽數(shù)等綜合考慮，推薦白糖作為大規(guī)模生產(chǎn)白鶴芋組培苗增殖生長(zhǎng)的最經(jīng)濟(jì)有效的糖源。

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Effect of several factors on shoots growth and proliferation of Spathiphyllum floribundum in bioreactor

HAN Lu1, XIU Jingrun2, DAI Yue2, LIAN Meilan1, YIN Guanhao3, JIN Meiyu1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China2.YanbianAcademyofAgriculturalSciences,LongjingJilin133400，China；3.Agro-TechExtensionandServiceCenterofYanbian,YanjiJilin133000,China)

In order to find a simple, low cost and large-scale production way for producingSpathiphyllumfloribundumshoots,Spathiphyllumfloribundumshoot (2 cm) as explant, several factors affecting on the growth ofSpathiphyllumfloribundumshoots were investigated. The results showed that raft culture in bioreactors was favorable for shoot growth with dark-green in leaf color, fresh weight and dry weight were higher than others. Meanwhile, 60 inoculation and air volume of 0.3 vvm were best for shoots proliferation. It is a cost-saving way for large-scale culture when white sugar selected as source of carbon for the growth ofSpathiphyllumfloribundumshoots.

Spathiphyllumfloribundum; tissue culture plants; inoculation density; air volume; Bioreactor

2016-10-15 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30860176)； 2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(ydbksky2016343)

韓璐(1994—)，女，吉林松原人，在讀學(xué)士，研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)及反應(yīng)器應(yīng)用。金美玉為通信作者，

E-mail:jinmeiyu@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0313-04

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.006

S682.19

A