徐加發(fā)蔡瑤

1 江蘇碩世生物科技股份有限公司 （江蘇 泰州 225300）2 江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局認證審評中心 （江蘇 南京 210002）

◎ 標準檢測

淺析體外診斷試劑穩(wěn)定性研究

徐加發(fā)1蔡瑤2

1 江蘇碩世生物科技股份有限公司 （江蘇 泰州 225300）2 江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局認證審評中心 （江蘇 南京 210002）

穩(wěn)定性作為檢測體系的關(guān)鍵技術(shù)指標之一，對體外診斷試劑的安全有效具有重要的指導意義。本文從診斷試劑上市前研究過程中涉及到的穩(wěn)定性類型及相關(guān)要求方面，對其進行了闡述。

體外診斷試劑 穩(wěn)定性

Abstract: Stability is one of the key technical indexes of the detection system, which is of great significance to the safety and effectiveness of in vitro diagnostic reagents.The stability types of in vitro diagnostic reagents were discussed here, as well as the related requirements which should meet before marketing.

Key words: in vitro diagnostic reagents, stability

體外診斷試劑穩(wěn)定性的定義在GB/T 29791.1-2013中有明確描述：體外診斷醫(yī)療器械在制造商規(guī)定界限內(nèi)保持其性能特性的能力[1]。該標準中明確了穩(wěn)定性適用的三種情形：一是適用于當體外診斷試劑、校準物或控制物在制造商規(guī)定的條件下儲存、運輸和使用時；二是按照制造商使用說明制備、使用和貯存的復溶后凍干材料、工作液和從密閉容器中取出的材料；三是校準后的測量儀器或測量系統(tǒng)，對體外診斷試劑而言，測量系統(tǒng)的穩(wěn)定性通常用時間來量化。

穩(wěn)定性作為體外診斷試劑保持產(chǎn)品安全有效的重要指標，對產(chǎn)品的生產(chǎn)、運輸、保存和使用等環(huán)節(jié)具有重要的指導意義。美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）在其指南EP25-A中，對體外診斷試劑穩(wěn)定性研究的目標、穩(wěn)定性研究計劃、穩(wěn)定性研究過程路徑，以及實時穩(wěn)定性、加速穩(wěn)定性研究方法等都作了詳細的描述[2]。在附錄中，還結(jié)合具體實例分析了測量漂移（Measure and Drift）、將加速穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)用阿倫尼烏斯方程（Arrhenius Equation）推導產(chǎn)品保存期限，以及基于線性回歸分析來確定穩(wěn)定性研究中的時間點設(shè)置等。該指南為體外診斷試劑的穩(wěn)定性研究提供了重要的技術(shù)參考。國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）在2014年9月5日發(fā)布的《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告（2014年第44號）》中，對體外診斷試劑的穩(wěn)定性研究提出了明確要求：包括至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的實時穩(wěn)定性研究資料，并應當充分考慮產(chǎn)品在儲存、運輸和使用過程中的不利條件，進行相應的穩(wěn)定性研究；應當詳細說明穩(wěn)定性研究方法的確定依據(jù)及具體試驗方法、過程[3]。下面結(jié)合體外診斷試劑研究中涉及的穩(wěn)定性要求作如下分析。

1.實時/效期穩(wěn)定性

診斷試劑的實時穩(wěn)定性對于確定產(chǎn)品的有效期具有重要意義[4]。實時穩(wěn)定性研究應將至少三個批次的產(chǎn)品，按照制造商聲稱的條件，例如溫度、濕度等，考察至預期的有效期后，按照產(chǎn)品技術(shù)要求進行全性能檢測。在考察過程中，應結(jié)合產(chǎn)品情況，合理設(shè)置考察時間點，對環(huán)境影響敏感、保存要求較高的產(chǎn)品，建議增加相應的時間點，以及時了解產(chǎn)品性能。實時穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、研究所用試劑、儀器以及校準品和質(zhì)控品的信息、具體的研究方法及評價指標、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。

2.加速穩(wěn)定性

對于體外診斷試劑而言，加速穩(wěn)定性通常指在非試劑說明書中聲稱的儲存條件下的穩(wěn)定性考察。加速穩(wěn)定性旨在考察試劑在特定的極端環(huán)境中，試劑的技術(shù)指標是否還在可接受的合理區(qū)間，以評估試劑的性能。通常情況下，考慮到大多數(shù)試劑中主要組成成分為蛋白類物質(zhì)，在試劑實際儲存溫度的基礎(chǔ)上，升高溫度來考察加速穩(wěn)定性是最常用的方式，即我們通常所講的熱穩(wěn)定性。需要注意的是，盡管加速穩(wěn)定性試驗是考察診斷試劑性能的一種常見方法，但是CFDA仍然期望產(chǎn)品的穩(wěn)定性結(jié)論是基于產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)。在CFDA發(fā)布的眾多體外診斷試劑行業(yè)標準中，通常提供了效期穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性兩種方式進行驗證，但是均注明了熱穩(wěn)定性不能用于推導產(chǎn)品有效期，除非是采用基于大量的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)建立的推導公式。雖然加速穩(wěn)定性研究結(jié)論不能直接用于聲稱產(chǎn)品有效期，但是考慮到試劑在運輸和使用過程中可能遇到的不確定性，產(chǎn)品加速穩(wěn)定性研究仍具有重要意義。

3.開瓶/封穩(wěn)定性

開瓶/封穩(wěn)定性旨在考察試劑在正常使用條件下，外界因素對試劑性能指標的影響。對于很多生化類試劑而言，受空氣影響較明顯，比如含有NaOH的生化類試劑，吸收了空氣中的CO2，導致試劑中NaOH的濃度下降，直接影響試劑分析質(zhì)量；還原型輔酶I（NADH）、鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）以及其他部分發(fā)光底物等一些穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，也會因暴露于空氣中而影響測定效果[5]。對于免疫類試劑，由于其主要組成成分為抗原、抗體和酶等蛋白類物質(zhì)，此類試劑除與空氣接觸影響試劑的酸堿度外，微生物污染也是很重要的因素，因此對此類試劑進行開瓶穩(wěn)定性研究是非常必要的[6]。另外，對于膠體金試紙條/卡，由于生產(chǎn)時的低濕度要求，在開封時直接吸收空氣中水分，也必須對開封后使用期限有明確要求。通常而言，開瓶穩(wěn)定性的研究建議考察三批次樣品，按照說明書的操作要求，合理設(shè)定時間間隔，在不同時間點，按照試劑的技術(shù)指標，對其進行檢測，以確定試劑的開封有效期。

4.復溶穩(wěn)定性

復溶穩(wěn)定性主要是考察試劑盒中或者與試劑盒配套使用的干粉在規(guī)定條件下用指定的溶劑溶解后，是否影響試劑的性能。目前在臨床實驗室中，干粉試劑主要是用于質(zhì)量控制和校準活動的干粉質(zhì)控品和校準品。與液體試劑相比，干粉質(zhì)控品有效期較長，穩(wěn)定性好，另外，干粉質(zhì)控品一般都是很多項目質(zhì)控物的混合，能同時對多個項目進行質(zhì)控，因此，好的干粉質(zhì)控品對檢測結(jié)果的質(zhì)量有著非常重要的影響[7]。對于干粉試劑的復溶穩(wěn)定性，一般要選擇三個批次考察準確度、批內(nèi)精密度和批間精密度等指標。在復溶條件的建立時，應充分考慮諸如溫度、溶劑等因素，并嚴格按照復溶的要求操作，減少非產(chǎn)品因素導致的誤差，保證質(zhì)控結(jié)果和臨床檢驗結(jié)果可靠和準確。一般情況下，粉末狀態(tài)的產(chǎn)品均需要提供復溶穩(wěn)定性的研究資料，除非是復溶后立即且一次性適用的產(chǎn)品，這種情況下對復溶穩(wěn)定性不作要求。另外，對于有些產(chǎn)品而言，開封穩(wěn)定性就是復溶穩(wěn)定性，比如某些凍干粉，開封后即用緩沖液溶解，并按照說明書的要求進行保存，因此選擇開封或者復溶穩(wěn)定性中的一項進行研究即可。

5.樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性的研究對于實驗的成敗也至關(guān)重要。很多試劑的檢測對象為抗原抗體等蛋白質(zhì)類目標物以及DNA和RNA等核酸類物質(zhì)。如前所述，蛋白類物質(zhì)易受溫度變化以及微生物污染等因素影響，出現(xiàn)蛋白變性、沉淀或降解等現(xiàn)象。因此，應提供對樣本的保存溫度、保存時間、凍融次數(shù)等方面的詳細研究資料。對于RNA和DNA這類核酸樣本而言，也易受外界環(huán)境的干擾出現(xiàn)降解、斷裂等情況。特別地，當使用組織標本時（如石蠟包埋的病理切片），經(jīng)過化學試劑處理后，核酸序列的完整性容易遭到破壞。因此，也應對諸如保存時間及溫度等進行研究[8]。另外，考慮到核酸分離、純化以及保存對待測物的影響，應對核酸分離/純化前樣本穩(wěn)定性和分離/純化后核酸在儲備液中的穩(wěn)定性進行研究。

6.運輸穩(wěn)定性

體外診斷試劑運輸穩(wěn)定性主要是考察試劑在實際銷售運輸過程中的各種條件，對診斷試劑性能的影響。目前進行運輸穩(wěn)定性主要有模擬試驗和實際運輸兩種方式。在進行運輸穩(wěn)定性之前，應掌握試劑在實際銷售過程中的運輸情況，對于大多數(shù)試劑而言，在實際運輸穩(wěn)定性研究時，結(jié)合目前實際，選取終端客戶最遠端，充分考慮天氣條件、貨物轉(zhuǎn)運周期及運輸方式，將產(chǎn)品遞送至目的地，在此過程中，實時記錄溫度和濕度等參數(shù)，在此條件下評估產(chǎn)品的性能。運輸穩(wěn)定性的研究建議結(jié)合目前監(jiān)管部門對體外診斷試劑冷鏈管理的有關(guān)要求執(zhí)行。對于模擬試驗，運輸條件的模擬應當基于對實際運輸條件的了解，如運輸時間、預溫度和濕度等）。值得注意的是，對于不同類型的產(chǎn)品，影響運輸穩(wěn)定的因素各有側(cè)重，比如膠體金試紙條類產(chǎn)品，只要保證密封良好，運輸過程中濕度的要求可以適當放寬；對于核酸類試劑，必須要保證運輸過程的溫度要符合企業(yè)的要求。

隨著大眾醫(yī)療需求的不斷提高，高質(zhì)量的體外診斷信息，對于切實發(fā)揮臨床診斷的指導作用具有重要意義，而體外診斷試劑的穩(wěn)定是臨床診斷信息質(zhì)量的重要保證，因此，建議診斷試劑制造商重視體外診斷試劑的穩(wěn)定性研究，按照法規(guī)要求，結(jié)合產(chǎn)品實際，規(guī)范、合理地開展研究工作，保證體外診斷試劑的安全有效。

[1] GB/T 29791.1-2013 體外診斷醫(yī)療器械 制造商提供的信息標示 第1部分:術(shù)語定義和通用要求[S].北京:中國標準出版社,2013.

[2] EP25-A:Evaluation of Stability of In Vitro Diagnostic Reagents;Approved Guideline,EP25A,2009.

[3] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告(2014年第44號)[Z].2014.

[4] 張妍,王治國.體外診斷試劑的穩(wěn)定性測試[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2012,27(2):161-162.

[5] 張力心.淺議生化類體外診斷試劑開瓶穩(wěn)定性[J].中國衛(wèi)生標準管理,2016,7(1):135-136.

[6] 鄧建平,朱海波,徐繼勛,等.改良試劑瓶提高生化試劑開瓶穩(wěn)定性的應用研究[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2010,25(1):91-94.

[7] 鄭松柏,莊俊華,王建兵,等.復溶過程中多種因素對干粉質(zhì)控品檢測結(jié)果的影響評估[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2012,33(15):1866-1869.

[8] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑技術(shù)審查指導原則[Z].2014.

The Analysis of Stability of In Vitro Diagnostic Reagents

XU Jia-fa1CAI Yao2
1 Jiangsu Bioperfectus Technology Co., Ltd. (Jiangsu Taizhou 225300)2 Jiangsu Provincial Food and Drug Administration Certification and Evaluation Center (Jiangsu Nanjing 210002)

1006-6586(2017)15-0030-03

R446

A

2017-06-19

徐加發(fā)，博士，工程師，主要負責IVD 產(chǎn)品及臨床檢驗類醫(yī)療儀器的臨床試驗、產(chǎn)品注冊等相關(guān)工作；蔡瑤，碩士，主要負責IVD產(chǎn)品的注冊審評工作。