李天芝，于新友

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600)

雞白痢診斷抗原的研制

李天芝，于新友

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600)

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)型C79-1和C79-7雞白痢雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株，制備了雞白痢雞傷寒平板凝集試驗染色診斷抗原。該抗原特異性強，與雞新城疫、雞傳染性鼻炎、雞支原體等9種雞血清無交叉反應(yīng)，敏感性高，穩(wěn)定性好，4℃保存36個月，檢測效果不變，應(yīng)用此抗原檢測雞白痢雞傷寒沙門氏菌抗體，檢測快速，操作簡便，適于大規(guī)模臨床樣品檢測。

雞白痢雞傷寒沙門氏菌，平板凝集；研制；應(yīng)用

雞白痢-禽傷寒病是由腸桿菌科沙門菌屬的雞白痢沙門菌和禽傷寒沙門菌感染引起的禽類疾病[1]。這兩種菌同屬于沙門菌的D血清群，由于雞白痢和禽傷寒在臨床癥狀、病理變化、診斷及防控等方面有許多相似之處，一般統(tǒng)稱為雞白痢。雞白痢雖危害不劇烈，但在雞場中長期存在，流行范圍廣，種雞感染后，不僅影響自身的生產(chǎn)性能，長期隱性帶菌，還能傳給后代，至雛雞大批發(fā)病、死亡，是最為重要的“蛋傳性”、細(xì)菌性禽類疾病之一[2]，嚴(yán)重困擾養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，沙門氏菌還可以感染人，存在潛在的食品安全威脅，可能導(dǎo)致難以估計的損失。目前，國內(nèi)外尚無有效疫苗預(yù)防，藥物防治容易產(chǎn)生耐藥性，種雞凈化是防治該病的有效手段，在我國一般要求種雞群的白痢陽性率不能超過0.2%[3]。國務(wù)院頒布的《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012～2020年）》提出，2020年全國所有種雞場的雞白?。ㄉ抽T氏菌）達到凈化標(biāo)準(zhǔn)[4]。雞白痢的凈化的關(guān)鍵步驟是對種雞的檢疫。平板凝集診斷法是檢疫雞是否患白痢最常用的方法，該法具有靈敏度高、操作簡便、成本低、適于大量樣品的快速檢測等多種優(yōu)點。本研究成功研制了雞白痢雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原，并應(yīng)用于臨床檢測，為雞白痢的凈化工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與標(biāo)準(zhǔn)血清標(biāo)準(zhǔn)型C79-1和C79-7雞白痢雞傷寒沙門氏菌購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定。

1.2 試劑氯化鈉(分析純)、甲醛溶液(37.0%～40.0%，分析純)、1:500吖啶黃溶液、磷酸鹽緩沖鹽水(0.07mol/L，pH7.0)，結(jié)晶紫、乙醇、甘油、普通瓊脂培養(yǎng)基、馬丁肉湯液體培養(yǎng)基、硫代硫酸鈉瓊脂培養(yǎng)基由本公司質(zhì)量監(jiān)察部提供。雞白痢雞傷寒多價染色平板凝集標(biāo)準(zhǔn)抗原、雞白痢雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)型與變異型陽性血清和陰性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，酪胨瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨湯培養(yǎng)基購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.3 雞白痢雞傷寒多價染色平板抗原的制備

1.3.1 菌液制備取凍干保存的標(biāo)準(zhǔn)型C79-1和C79-7雞白痢雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株菌種，分別劃線接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，選擇典型的光滑型菌落，接種于馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24h，經(jīng)肉眼及顯微鏡檢，選取純粹的菌作為菌種，接種于硫代硫酸鈉瓊脂扁瓶，每瓶5ml，搖晃均勻，置37℃培養(yǎng)48h，逐瓶用肉眼檢查，棄去污染雜菌者。

1.3.2 收獲與滅活吸棄扁瓶中凝集水，每瓶加入含2%甲醛溶液的磷酸鹽緩沖鹽水（0.07mol/L，pH7.0）30ml，洗下培養(yǎng)物，收集于帶玻璃珠的玻瓶中，經(jīng)振蕩打碎菌塊，置37℃滅活48h，期間振蕩數(shù)次，后作無菌檢驗。然后用滅菌的棉花紗布漏斗濾過菌液于大玻璃瓶中，加入約2倍量（以菌體全部沉淀為準(zhǔn)）的95%乙醇，沉淀3日以上，棄去上清，下沉物再離心，棄上清，離心沉淀物加含1%甲醛溶液的磷酸鹽緩沖鹽水（0.07mol/L，pH7.0）懸浮，用1號耐酸濾器濾過，然后按麥?zhǔn)媳葷峁艿谝还埽ㄏ喈?dāng)于3億菌/ml）為標(biāo)準(zhǔn)進行比濁，確定其菌液濃度，計算出配制抗原所需各組分的用量。

1.3.3 抗原配制將所需的1%甲醛溶液緩沖鹽水和1%結(jié)晶紫乙醇溶液（抗原中結(jié)晶紫最終含量為0.03%）在勻漿機中以7000r/min均質(zhì)3min，然后加入最終含量為10%的甘油，繼續(xù)均質(zhì)4min，最后加入菌液再以2000r/min均質(zhì)2min即成。

1.4 多價染色平板抗原檢驗

1.4.1 物理性狀主要觀察抗原的顏色、劑型，是否有自凝集等。

1.4.2 無菌檢驗隨機取樣品5瓶樣品，按照《中華人民共和國獸藥典》2015年版三部附錄3306進行無菌檢驗。

1.4.3 效價測定在平板上分兩處各滴抗原1滴，每滴為0.05ml。然后分別滴加雞白痢雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)型與變異型陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品各0.05ml，混合。

1.4.4 特異性檢驗在平板上滴加抗原12滴，再分別滴加雞新城疫、雞傳染性鼻炎、雞傳染性法氏囊病、雞支原體、雞傳染性支氣管炎、禽流感、雞大腸桿菌、雞喉氣管炎、雞傳染性貧血等陽性血清、雞白痢雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)型與變異型陽性血清、陰性血清各1滴，進行平板凝集試驗。

1.5 多價染色平板抗原的臨床應(yīng)用應(yīng)用研制的診斷抗原，對山東濱州某雞場白痢的流行情況進行調(diào)查，針頭刺破雞的肱靜脈，每只取血0.05ml，取等量抗原，混合均勻后，涂散至直徑約2cm的液面。2min內(nèi)判斷結(jié)果：發(fā)生50%（++）以上凝集著為陽性，不發(fā)生凝集著為陰性反應(yīng)，介于上述兩者之間者為可疑反應(yīng)。共檢驗300只雞，用購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的雞白痢雞傷寒多價染色平板凝集標(biāo)準(zhǔn)抗原進行符合試驗。

2 結(jié)果

2.1 染色平板抗原的物理性狀觀察本品為紫色的混懸液，靜置后菌體下沉，經(jīng)振蕩后呈均勻的懸液。將其滴于平板，在2min內(nèi)不出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。

2.2 無菌檢驗觀察10d，制備的抗原樣品無細(xì)菌生長。

2.3 效價測定在2min之內(nèi)液滴中有明顯凝集塊或粒狀凝集物，液體幾乎完全清亮。約75%凝集。

2.4 特異性試驗制備的染色抗原除與雞白痢雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)型與變異型陽性血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)外，其余9種血清均無凝集反應(yīng)。

2.5 臨床應(yīng)用用兩種抗原檢測的結(jié)果完全相同，雞白痢抗體陽性雞8只，陽性率2.6%，可疑雞4只，比率為1.3%，二者符合率為100%，說明自制的平板凝抗原可用于臨床種雞場雞白痢的凈化檢測工作。

3 討論與小結(jié)

3.1 李磊等[5]從鄭州某雞場死亡雛雞的肝臟、脾臟和腎臟中分離純化細(xì)菌，通過致病性試驗、生化試驗，并結(jié)合臨床癥狀、病理變化和培養(yǎng)特性鑒定為雞白痢沙門氏菌。經(jīng)傳代分離株、培養(yǎng)細(xì)菌、收集細(xì)菌、滅活細(xì)菌、濃縮抗原、調(diào)整抗原濃度、無菌檢查及染色制備雞白痢沙門氏菌平板凝集抗原，建立了檢測雞白痢血清抗體的微量平板凝集法。

3.2 本研究成功研制了300ml雞白痢雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原，敏感性高，穩(wěn)定性好，與其它血清無交叉反應(yīng)，適合基層獸醫(yī)工作部門和雞場雞白痢的抗體檢測及流行病學(xué)調(diào)查，應(yīng)用效果良好。在診斷抗原的研制過程中也遇到了一些問題，一開始做出的抗原顏色較淡，檢測結(jié)果不易判定，后換了另一公司的結(jié)晶紫，才達到了理想的結(jié)果。

3.3 雞白痢平板凝集診斷法對雛雞的診斷效果差，適用于成年雞[6]，平板凝集法在臨床檢測應(yīng)用中容易造成誤差，主要注意事項如下：

3.3.1 抗原在使用前必須充分搖均勻，有沉淀的不能用，過期失效的不能用。

3.3.2 做本試驗前必須做陰、陽血清對照。滴管每次一換，不能重復(fù)使用。

3.3.3 平板凝集反應(yīng)時間一般為2min，但也不能一概而論，凝集反應(yīng)要控制在20～25℃下進行，溫度高時可適當(dāng)縮短反應(yīng)時間，溫度低時可適當(dāng)延長反應(yīng)時間，可對凝集反應(yīng)適當(dāng)加熱，具體操作可用一潔凈小箱上鋪玻璃板，內(nèi)設(shè)1～2個25W燈泡，既可照明，又可提高反應(yīng)溫度，提高檢測的真準(zhǔn)確性。從冰箱取出抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清、待檢樣品，待其達到室溫再做檢驗。

3.3.4 對經(jīng)驗不足的操作著，當(dāng)檢驗的樣本量不大時，最好能在采血后，分離血清，用血清做檢驗，效果更好。

3.3.5 檢疫時用過的反應(yīng)板如果需要重復(fù)利用時，要先用水洗凈擦干，再用酒精棉脫脂，用紗布擦干或涼干，否則上次檢疫殘留物易造成影響[7]。

3.3.6 有時現(xiàn)場有大量雞需要檢測時，所用注射器或滴管數(shù)量很大，需要重復(fù)利用，清洗時要用生理鹽水，不能用蒸餾水，因為蒸餾水與紅血球接觸后，即產(chǎn)生溶血，造成檢測反應(yīng)的假陽性。

3.3.7 在現(xiàn)場檢疫過程中，有時雞舍內(nèi)灰塵過大，落在反應(yīng)板上往往誤診為凝集顆粒，應(yīng)特別引起注意的，凝集反應(yīng)操作時應(yīng)避免風(fēng)吹和曝曬，抗原、血清的滴加量一定要準(zhǔn)確。

3.4 本研究所采用的菌種購自中國獸醫(yī)藥品檢查所，所包括的血清型有限，能檢測的血清型也是有限的，存在漏檢的可能性，下一步工作可以分離其它血清型沙門氏菌，并借鑒該研究的方法，制備成診斷抗原，減少漏檢。

[1]劉鵬義.種雞場雞白痢-禽傷寒病凈化工作的總結(jié)[J].中國家禽，2008，30(17)：50-51.

[2]談建明，劉福安.禽白血病檢測方法的建立和比較[J].上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1990，8(2)：101-107.

[3]康永剛，廖云瓊，薛忠.雞白痢和禽傷寒綜合防治措施[J].中國畜禽種業(yè)，2012，1：141-142.

[4]馮永平.種雞場雞白痢的凈化與防控[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2015，306(06)：73-74.

[5]李磊，婁興國，李永強，等.雞白痢沙門氏菌平板凝集抗原的制備[J].河南畜牧獸醫(yī)(綜合版)，2008，29 (09)：9-10.

[6]曹澍澤，郭玉璞，董國維，等.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社出版，1992：301-302.

[7]李躍庭.雞病現(xiàn)地平板快速診斷[J].山東養(yǎng)禽，1983，2：60-61.□

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