張 恒

大黃魚變形假單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

張 恒

大黃魚隸屬鱸形目，石首魚科，黃魚屬，為我國(guó)傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”之一。目前，大黃魚是我國(guó)單一品種養(yǎng)殖量最大的海水魚類之一。有關(guān)大黃魚病原菌已經(jīng)報(bào)道的有哈維氏弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌等，假單胞菌可引起魚類的內(nèi)臟組織病變，本文從發(fā)病的大黃魚中分離得到假單胞菌，并對(duì)該菌的生物學(xué)特性以及對(duì)藥物的敏感性進(jìn)行相應(yīng)研究，以期為該病的鑒定和水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

發(fā)病的大黃魚取自福建省某大黃魚養(yǎng)殖基地，體長(zhǎng)大約20cm，體表外觀未見明顯癥狀變化，采食減少，解剖后，腹腔中有積液，內(nèi)臟組織病變嚴(yán)重，肝臟腫大易碎，脾臟和腎臟有白色的結(jié)節(jié)。

1.1.2 試劑和儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、酶標(biāo)條、藥敏紙片、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)、精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱、全自動(dòng)化酶標(biāo)儀BIOTEK、Mini Spin臺(tái)式離心機(jī)、冷凍高速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離

在操作臺(tái)無菌的條件下取發(fā)病大黃魚的脾臟，接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA），在恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑取單菌落進(jìn)行多次劃線培養(yǎng)，將純化的菌落進(jìn)行保藏，并將純化后的菌落在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其形態(tài)并進(jìn)行染色。

1.2.2 生理生化鑒定

將純化后的菌落接種于生化鑒定管中，并根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

選用阿米卡星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素等20種藥物對(duì)該菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作。將2.0×108CFU/mL的菌懸液均勻的涂布在大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板上，并貼上藥敏紙片，放置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中18小時(shí)至24小時(shí)，觀察抑菌圈的大小。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離

經(jīng)過多次分離純化后得到一株優(yōu)勢(shì)菌株，該優(yōu)勢(shì)菌株在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，表明有薄菌膜，在固體培養(yǎng)基上呈白色、圓形、中央稍微突起，周邊較為圓潤(rùn)。該菌為革蘭氏陰性菌，呈直或微彎的桿菌，不呈螺旋狀，沒有菌柄也沒有鞘。

2.2 生理生化特性

該分離菌株氧化酶陽性，可以氧化分解葡萄糖以及木糖，產(chǎn)酸但是不產(chǎn)氣，不分解乳糖以及蔗糖。可分解尿素，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮?dú)?，其中分離菌株吲哚陰性。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》初步判定該菌株為變形假單胞菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)

按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作。將從發(fā)病魚分離得出的菌株均勻的涂布于固體培養(yǎng)基并貼上藥敏紙片，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)果顯示該菌株對(duì)妥布霉素、阿米卡星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素、替米考星、卡那霉素等8種藥物高度敏感；對(duì)哌拉西林、慶大霉素、紅霉素、羅紅霉素和先鋒霉素V等5種藥物中度敏感；該菌株對(duì)磷霉素、鏈霉素、利福平和菌必治等4種藥物耐藥。

3.討論

變形假單胞菌是自然環(huán)境中的常見菌，對(duì)多種污染物有較強(qiáng)的分解能力，常被用于污水處理。由變形假單胞菌引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病在大黃魚、香魚、虹鱒等品種已有報(bào)道，其造成的經(jīng)濟(jì)損失不容忽視。本研究從發(fā)病的大黃魚中分離出的優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)過形態(tài)和生理生化鑒定最終確定病原菌為變形假單胞菌。本研究分離的優(yōu)勢(shì)菌株理化特性與經(jīng)過《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》上變形假單胞菌的理化特性基本一致。

目前，水產(chǎn)動(dòng)物疫病的防治還在廣泛地使用抗菌類藥物，研究發(fā)現(xiàn)不同的變形假單胞菌菌株對(duì)抗菌類藥物的敏感性存在著一定的差異。分析其中的原因，可能與變形假單胞菌的來源有關(guān)，分離自不同來源的變形假單胞菌對(duì)藥物的敏感性研究結(jié)果不完全相同。這表明變形假單胞菌對(duì)抗菌藥物的敏感性存在著差異，這與不同的區(qū)域、不同的病原體、不同的養(yǎng)殖環(huán)境以及日常飼養(yǎng)管理過程中使用藥物的種類以及使用量的不同有關(guān)。

（通聯(lián)：072550，河北省保定市徐水縣獸醫(yī)局）