謝光友，耿濤，楊海濤，呂富榮，曾憲春，劉昌杰，楊明放，王榮品

2001年Zuk等[1]首次從人抽脂術(shù)中分離培養(yǎng)出ADSCs，相繼證實ADSCs具有向多胚層多功能細(xì)胞的分化潛能。磁探針SPIO-PLL制作簡單、易于排泄，MR成像無創(chuàng)且分辨率高，已成為示蹤移植干細(xì)胞的理想無創(chuàng)方法。本研究通過流式細(xì)胞技術(shù)分析不同濃度磁探針對ADSCs生長的影響，尋找安全標(biāo)記濃度，并行體外定量MR成像，為活體示蹤移植磁標(biāo)記細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Annexin-v-FITC細(xì)胞凋亡及周期檢測試劑盒(Becton Dickinson公司)，倒置相差熒光顯微鏡(NIKON TE2000-U)，透射電子顯微鏡(日本HITACHI-7500型)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，GE HD-X signa 3.0 T MRI成像系統(tǒng)(美國GE公司)、腕關(guān)節(jié)線圈等。ADSCs的培養(yǎng)鑒定、磁探針及Perls反應(yīng)液的制作見文獻[2]。

1.2 普魯士藍(lán)染色

取12孔板，每孔加入單細(xì)胞懸液1 ml (1×105個)，培養(yǎng)過夜后分別加25、50、75 μg/ml的磁探針培養(yǎng)液1 ml，未加探針組為空白對照組，各設(shè)3個復(fù)孔。孵育過夜后棄上清，PBS漂洗、4%多聚甲醛固定40 min，雙蒸水洗滌、Perls反應(yīng)液作用30 min、棄反應(yīng)液、雙蒸水洗滌、核固紅復(fù)染5 min、PBS洗滌、晾干、二甲苯透明處理10 min后中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.3 透射電鏡鑒定

收集各濃度組單細(xì)胞懸液1×106個，1200 r/min離心5 min后棄上清，沿管壁緩慢加入2.5%的戊二醛溶液4 ℃固定1 h，PBS洗滌，1%四氧化鋨4 ℃固定h，PBS洗滌，梯度丙酮脫水，0.5%醋酸鈾4 ℃染色固定過夜，環(huán)氧樹脂包埋，切片，透射電鏡觀察。

1.4 流式檢測細(xì)胞凋亡

收集各濃度組及對照組細(xì)胞各1 ml (1×106個)，離心后PBS洗滌，將細(xì)胞重懸浮于200 ml結(jié)合緩沖液，加10 ml Annexin-v-FITC，室溫避光放置10 min，再加5 μl碘化丙啶(PI)，混勻后室溫避光放置15 min，PBS洗滌，加300 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后上機檢測。細(xì)胞凋亡圖左下象限An (-) PI (-)，右下象限An (+) PI (-)，右上象限An(+) PI (+)，左上象限An (-) PI (+)分別代表正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡及壞死細(xì)胞及收集過程中的損傷細(xì)胞。

1.5 流式分析細(xì)胞周期

收集各濃度組及對照組細(xì)胞各1 ml (1×106個)，離心PBS洗滌，70%乙醇固定，4 ℃放置過夜，PBS洗滌，加20 mg/ml核糖核酸酶A(RNaseA)，37 ℃水浴1 h后加100 mg/l PI，4 ℃避光染色30 min，行流式細(xì)胞儀490 nm處檢測并行細(xì)胞周期DNA含量分析。

1.6 定量MR成像

收集經(jīng)25μg/ml磁探針標(biāo)記的細(xì)胞 5×105個(1 d)、1×106個(1 d)、1×106個(3 d)及1×106個(未標(biāo)記)，轉(zhuǎn)入裝有1%瓊脂糖溶液的EP管中振蕩混勻，置入腕關(guān)節(jié)線圈內(nèi)，行GE HD-X signa 3.0 T GRE T2*WI及多回波T2*mapping序列掃描，通過adw 4.6工作站的Functool軟件包中的T2*弛豫時間測量軟件，選取ROI測量各組T2*弛豫時間。T2*WI成像參數(shù)：TR 250 ms，TE 12 ms，F(xiàn)OV 8 cm×8 cm，層厚2 mm，層間距0.5 mm，NEX為3，矩陣324×256，反轉(zhuǎn)角20°。T2*mapping成像參數(shù)：TR 1000 ms，TE 11.1、22.2、33.3、44.4、55.5、66.6、77.7、88 ms，F(xiàn)OV 8 cm×8 cm，層厚2 mm，層間距0 mm，矩陣320×224。

1.7 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用表示，多組間比較用單因素方差分析方法，兩兩間比較應(yīng)用LSD-t方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 普魯士藍(lán)染色及電鏡

光鏡下示磁標(biāo)記細(xì)胞普魯士藍(lán)陽性染色率近100%，胞漿內(nèi)見藍(lán)色致密顆粒，數(shù)量不等(圖1A)。透射電鏡示磁標(biāo)記細(xì)胞漿內(nèi)見斑點狀的高密度氧化鐵顆粒，聚集在胞漿的囊泡內(nèi)(圖1B)。

圖1 A：磁標(biāo)記細(xì)胞普魯士藍(lán)染色( ×400)胞漿內(nèi)見藍(lán)色鐵顆粒(白箭)；B：磁標(biāo)記細(xì)胞透射電鏡觀察( ×15000)胞漿囊泡見致密鐵顆粒(白箭) 圖2 Annexin/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡。A～D分別為對照組、25、50、75 μg/ml磁探針標(biāo)記細(xì)胞組 圖3 GRE T2*WI序列軸面成像。1～6組分別為蒸餾水、瓊脂、1×106個細(xì)胞(未標(biāo)記)、5×105個細(xì)胞(1 d)、1×106個細(xì)胞(3 d)、1×106個細(xì)胞(1 d)，第6組信號強度最低Fig. 1 A: The labelled cells Prussian blue staining ( ×400) Blue particles were observed in nearly every cytoplasm (white arrow). B: The labelled cells observed under TEM ( ×15000). The dense particles were observed in cytoplasmic vacuoles (white arrow). Fig. 2 The cell apoptosis rate detected through Annexin/PI double staining method. A—D respresented blank group, ADSCs labelled with 25, 50, 75 μg/ml SPIO-PLL respectively. Fig. 3 The axial image of GRE T2*WI sequences. 1—6 groups represented distilled water, agar, 1×106 cells (unlabeled), 5×106 (labeled 1 d), 1×106 (labeled 3 d) and 1×106 cells (labeled 1 d), respectively, the SI of the sixth group was the lowest.

表1 SPIO-PLL對細(xì)胞周期與凋亡的影響(n=3，%，Tab.1 Effects of SPIO-PLL on ADSCs cell cycle progression and apoptosis(n=3, %

表1 SPIO-PLL對細(xì)胞周期與凋亡的影響(n=3，%，Tab.1 Effects of SPIO-PLL on ADSCs cell cycle progression and apoptosis(n=3, %

注：a，與空白對照組比較，P＜0.01

分組 G0/G1 細(xì)胞周期S G2/M 凋亡率空白對照組25μg/ml組50μg/ml組75μg/ml組9.939 0.004 70.73±1.40 72.34±3.71 82.70±1.95a 83.89±2.66a 12.83±0.29 12.47±1.76 7.45±1.51a 7.13±2.70a 16.44±1.43 15.19±2.30 9.85±0.56a 8.98±1.28a 8.73±1.94 12.92±4.87 20.49±3.53a 22.41±3.12a F值P值21.099 0.000 9.040 0.006 18.190 0.001

2.2 對細(xì)胞周期和凋亡的影響

經(jīng)25、50、75 μg/ml磁探針標(biāo)記細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期，50、75 μg/ml組G0/G1阻滯率較空白對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而25 μg/ml組與空白對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。運用Annexin/PI雙染色，流式細(xì)胞儀檢測各組間凋亡率具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，其中25 μg/ml組與對照組間比較無明顯差異(P＞0.05)，為安全標(biāo)記濃度(圖2，表1)。

2.3 MR成像

收集的各組細(xì)胞置入腕關(guān)節(jié)線圈內(nèi)，行GE HD-X signa 3.0 T MRI掃描，GRE T2*WI序列掃描顯示經(jīng)25 μg/ml磁探針標(biāo)記1×106個(1 d)的信號強度最低(圖3)；經(jīng)多回波T2*mapping序列掃描后，測量1～6組T2*弛豫時間分別為(17.30±0.44) ms、(17.27±0.55) ms、(16.63±0.86) ms、(10.10±0.40) ms、(10.17±0.31) ms、(9.33±0.42) ms，對照組與各磁標(biāo)記細(xì)胞組T2*弛豫時間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=169.837，P＜0.01)。

3 討論

2001年Zuk首次從抽脂術(shù)中分離培養(yǎng)出ADSCs，2004年ADSCs首次被移植治療一位顱面部嚴(yán)重?fù)p傷的患兒，并取得了滿意的療效[3]。目前ADSCs作為一種多功能的成體干細(xì)胞，已經(jīng)實現(xiàn)自體、異體及異種移植，相繼被移植用于治療外周神經(jīng)及肌腱韌帶損傷、椎間盤退變、克羅恩病以及抑制排斥反應(yīng)等[4-7]。本研究聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)染劑PLL與SPIO制成理化性質(zhì)穩(wěn)定的SPIO-PLL懸液，具有正電效應(yīng)，能與帶負(fù)電的細(xì)胞膜高親和力結(jié)合形成囊泡內(nèi)吞進入細(xì)胞，同時又有明顯的負(fù)性效應(yīng)[8]；本研究結(jié)果證實普魯士藍(lán)染色及透射電鏡示ADSCs磁標(biāo)記率近100%，鐵顆粒以囊泡的形式內(nèi)吞入細(xì)胞漿。納米鐵生物降解性強，能夠通過旁路代謝進入血漿鐵池并參與鐵的循環(huán)代謝，因此SPIO-PLL是一種理想的MR活體示蹤劑，可安全高效標(biāo)記不同物種的多種細(xì)胞[9-12]。

細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞死亡，前者是一種由基因調(diào)控的主動程序性死亡過程，檢測凋亡的方法及特點：(1)顯微鏡只局限于觀察細(xì)胞的形態(tài)；(2)電泳法不能清晰顯示細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；(3)免疫學(xué)法不能實現(xiàn)細(xì)胞的準(zhǔn)確定位；(4)原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)難以控制處理時間；(5)流式法，聯(lián)合應(yīng)用熒光探針Annexin-v-FITC與核酸染料PI能區(qū)分凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸外露早于細(xì)胞的DNA，Annexin-V能與膜外的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，因此流式法能更敏感地檢測早期凋亡細(xì)胞；同時，流式法不需要固定細(xì)胞，避免因細(xì)胞固定過程中造成的細(xì)胞碎片過多及原位缺口末端標(biāo)記法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失，因此流式法檢測細(xì)胞凋亡更省時、結(jié)果更可靠，是最佳的凋亡定量檢測方法[13-15]。

細(xì)胞周期包括分裂間期和有絲分裂期(M期)，分裂間期又分為生長前期(G1期)，DNA合成期(S期)及生長后期(G2期)，各時期細(xì)胞的DNA含量均不同，與核酸染料PI結(jié)合后顯示的熒光強度不等，因此流式細(xì)胞儀可敏感檢測細(xì)胞的生長情況[16-17]。本研究表明隨著磁探針濃度增大，ADSCs的早晚期細(xì)胞凋亡率及壞死率增大，細(xì)胞周期阻滯率增高，以G0/G1期明顯，其中25μg/ml組細(xì)胞周期阻滯率及凋亡率與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，對細(xì)胞分裂增殖及凋亡無明顯影響，因此25μg/ml磁探針為有效安全標(biāo)記濃度。

本研究用磁探針標(biāo)記1×106、5×105個細(xì)胞1 d，1×106個細(xì)胞標(biāo)記1 d、3 d，后者弛豫時間均較前者短，這可能與細(xì)胞數(shù)量增多、培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞增殖分化能力及生物降解能力降低有關(guān)；用25μg/ml磁探針標(biāo)記1×106個細(xì)胞1 d后，T2*弛豫時間最短，有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，為下一步活體移植經(jīng)25μg/ml的磁探針標(biāo)記細(xì)胞，并運用T2*mapping技術(shù)定量評價移植細(xì)胞生長情況奠定基礎(chǔ)。雖然死亡細(xì)胞釋放出鐵粒子或巨噬細(xì)胞吞噬磁標(biāo)記細(xì)胞使周圍細(xì)胞或組織呈假陽性，干擾對移植細(xì)胞生長狀況的精準(zhǔn)靶向示蹤，但隨著示蹤技術(shù)的不斷改進，MRI在干細(xì)胞移植及示蹤領(lǐng)域會有光明的應(yīng)用前景。

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