黃明明，曹笑婉，沈桂權(quán)，李小寶，余暉

血管性認知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)是指由明顯的或不明顯的腦血管病以及腦血管病危險因素引起的認知障礙，它包括從輕度認知損害(mild cognitive impairment，MCI)到血管性癡呆(vascular dementia，VD)[1-2]，已成為嚴重影響老年人認知功能障礙的最常見的疾病類型之一。因此，VCI的早期診斷、及時干預對于阻止或延遲MCI向VD轉(zhuǎn)化具有重要的臨床意義。現(xiàn)有的影像學研究表明，由腦血管病變以及腦血管危險因素引起的腦結(jié)構(gòu)改變(腦梗死、白質(zhì)改變、腦萎縮)與認知功能障礙存在一定的相關性[3]。然而，由于影像學數(shù)據(jù)的局限性以及臨床病理學資料的缺乏，傳統(tǒng)的影像學指標還不足以用來表征VCI的病理改變進程，因此需要借助VCI的動物模型來進行研究。目前，改良的Pulsinelli四血管阻塞法(4-vessel occlusion，4-VO)法已被廣泛地用來復制VCI大鼠模型[4]，同時，1H-MRS是一種無創(chuàng)反映腦內(nèi)細胞代謝改變的技術(shù)，其代謝物濃度的變化可以在一定程度上反映疾病的病理生理改變[5]。因此，筆者嘗試利用3.0 T1H-MRS技術(shù)研究VCI大鼠在術(shù)后2周、1個月、3個月、5個月的大鼠腦內(nèi)包括海馬的代謝物濃度變化，評估3.0 T1H-MRS用于基礎動物研究的可行性，為VCI的病生理機制的研究和早期診斷提供可參考信息。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

雄性SD大鼠50只，體重約200 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(黔)2012-0001]；DMS2-Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)；5 cm四通道3.0 T小動物射頻線圈(眾志醫(yī)療科技有限公司)；3.0 T超導MRI掃描儀(PHILIPS Achieva 3.0 T X-Series，荷蘭)；春光充電式電凝筆(金環(huán)醫(yī)療用品)；小動物手術(shù)器械。

1.2 VCI模型建立

大鼠適應性喂養(yǎng)2周，隨機分為對照組20只、模型(VCI)組30只，VCI組大鼠均采用改良的Pulsinelli 4-VO模擬全腦慢性缺血過程制作VCI動物模型，具體過程：大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉(300 mg/kg)。手術(shù)第一天頸后正中切口，分離出第一頸椎兩側(cè)翼孔，用電凝筆凝閉雙側(cè)椎動脈，縫合；24 h后于大鼠頸部正中切開，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，穿線備用，用血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min，共夾閉3次，每次間隔1 h，制造大鼠全腦缺血性改變。對照組重復以上手術(shù)過程，只是不進行血管處理。由于實驗周期較長，5個月時VCI大鼠的成活率約為50%，而VCI早期2周時的存活率為80%。

1.3 Morris水迷宮實驗

所有大鼠均在術(shù)前、術(shù)后2周、1個月、3個月、5個月進行定向航行實驗和空間探索實驗，定位航行試驗將受試大鼠按順時針方向依次由第一、二、三、四象限入水點順序放人水中。記錄2 min內(nèi)尋找平臺的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內(nèi)找到平臺，記錄2 min中內(nèi)實際逃避潛伏期；在2 min內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期記錄為2 min?？臻g探索試驗定位航行試驗全部結(jié)束后，次日進行空間探索試驗。撤去平臺，然后選第一象限相同的入水點將大鼠面向池壁放人水中，測其2 min內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)和大鼠在平臺各象限停留的時間、距離，以判斷大鼠記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

1.4 1H-MRS掃描

所有大鼠均使用3.0 T人體掃描儀及小動物專用四通道相控陣表面線圈進行1H-MRS數(shù)據(jù)采集。10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉(300 mg/kg)。將大鼠頭部固定于動物專用四通道相控陣表面線圈。T2加權(quán)解剖結(jié)構(gòu)像，參數(shù)設置如下：視野大小3.5 cm×3.5 cm，采集矩陣256×128，片厚1 mm，片數(shù)20，TR 5800 ms，TE 80 ms。以T2加權(quán)解剖結(jié)構(gòu)像為基礎，活體波譜采用單體素點解析波譜(point resolved spectroscopy，PRESS)序列，譜寬4000 Hz，TR 2000 ms，TE 40 ms，波譜體元大小為5 mm×8 mm×8 mm，主要包括海馬、部分視皮層和紋狀體，掃描時間3 min 40 s。

1.5 病理學檢查

待所有實驗和MRI數(shù)據(jù)采集完畢后，將大鼠注射過量的10%水合氯醛進行麻醉，打開腹腔，經(jīng)左心室灌流300 ml生理鹽水和400 ml 4%多聚甲醛(Paraformaldehyde，PBS 配置，pH=7.4)。灌流完畢后，將大鼠斷頭取出大腦，分離出海馬結(jié)構(gòu)，用10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋和切片，分別進行蘇木素-伊紅染色(HE)和尼氏染色，觀察其形態(tài)學變化。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

水迷宮數(shù)據(jù)處理：實驗數(shù)據(jù)均以表示，實驗結(jié)果均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，對照組與VCI組不同時間點的比較采用ANOVA方差分析，P＞0.05方差齊(等)時采用LSD檢驗法，而P＜0.05方差不齊時采用Dunnett檢驗法，對照組與VCI組任意兩個時間點的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有大鼠的1H-MRS原始數(shù)據(jù)導入電腦工作站，應用LCModel軟件(LCModel version 6.3-1A；Stephen Provencher，Oakville，ON，Canada)自動對波譜數(shù)據(jù)進行基線校正和平滑處理，得到的主要代謝物包括總N-乙酰天冬氨酸(tNAA)：NAA及少許N-乙酰天冬氨酸谷氨酸(NAAG)、總肌酸(tCr)：Cr及磷酸肌酸(PCr)、總膽堿(tCho)：磷酸膽堿(PCh)及甘油磷酸膽堿(GPC)、肌醇(mI)、谷胱甘肽(GSH)、谷氨酸(Glu)、谷氨酸+谷氨酰胺(Glx)的濃度，所有代謝物濃度的誤差均控制在≤15%。同時，由于實驗動物來自于不同批次，為減小個體差異對實驗結(jié)果的影響，本次實驗數(shù)據(jù)均以上述代謝物與tCr的比值為準納入統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學觀測結(jié)果

與對照組相比，VCI 模型各組(2周、1個月、3個月、5個月)大鼠的學習和記憶能力明顯降低。VCI模型各組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長；第1次穿越平臺時間較對照組明顯延長；穿越站臺次數(shù)較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；VCI組術(shù)后1個月、3個月、5個月大鼠學習與記憶能力與術(shù)后2周比較、術(shù)后5個月大鼠與術(shù)后1個月比較降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但術(shù)后3個月大鼠逃避潛伏期、第1次穿越平臺時間、穿越站臺次數(shù)與術(shù)后1個月大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。術(shù)后5個月大鼠逃避潛伏期與術(shù)后3個月比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但第1次穿越平臺時間、穿越站臺次數(shù)較其變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各組大鼠水迷宮比較結(jié)果見表1。

2.2 1H-MRS數(shù)據(jù)的可重復性驗證

為了驗證數(shù)據(jù)的可重復性，選取了6只正常大鼠，將其在2周和1個月時采集的數(shù)據(jù)納入分析，采用配對t檢驗，發(fā)現(xiàn)所有代謝物的比值在2周和1個月時沒有差異(P＞0.05)見表2。

表1 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較Tab. 1 Comparative morris water maze test results in different rat groups

表1 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較Tab. 1 Comparative morris water maze test results in different rat groups

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與VCI組(2周)比較，P＜0.05；c與VCI組(1個月)比較，P＜0.05；d與VCI組(3個月)比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 逃避潛伏期(s) 空間探索實驗第1次穿越平臺時間(s) 穿越平臺次數(shù)對照組 10 16.59±9.08 8.79±3.81 4.40±1.78 VCI-2周 20 39.15±9.48a 21.37±7.04a 2.10±1.12a VCI-1個月 20 46.05±10.88ab 26.73±11.08ab 1.45±0.89ab VCI-3個月 20 48.31±10.48ab 29.03±13.87ab 1.35±0.99ab VCI-5個月 10 56.46±6.74abcd 34.53±11.25abc 1.10±1.07abc

表2 對照組相同大鼠在2周和1個月時各代謝物的比較Tab. 2 Comparation of metabolites at 2 weeks and 1 month in control rats

表2 對照組相同大鼠在2周和1個月時各代謝物的比較Tab. 2 Comparation of metabolites at 2 weeks and 1 month in control rats

組別 Glx/tCr Glu/tCr tNAA/tCr NAA/tCr GSH/tCr mI/tCr GPC/tCr tCho/tCr對照組2周 1.96±0.331.60±0.261.17±0.061.06±0.010.26±0.070.78±0.160.21±0.020.22±0.02對照組1個月 2.06±0.281.61±0.211.17±0.071.11±0.120.31±0.090.85±0.110.22±0.030.22±0.03 P值 0.78 0.57 0.56 0.31 0.77 0.85 0.79 0.98

表3 各組大鼠腦內(nèi)代謝物/tCr結(jié)果比較Tab. 3 Comparation of metabolities/tCr in different groups

表3 各組大鼠腦內(nèi)代謝物/tCr結(jié)果比較Tab. 3 Comparation of metabolities/tCr in different groups

注：c在2周時，與正常對照組2周比較，P＜0.05；使用獨立樣本t檢驗。b與對照組1個月比較，P＜0.05；方差分析時使用Dunnett檢驗。c與對照組2周比較，P＜0.05

VCI-5個月(6只)Glx/tCr 2.14±0.33 2.01±0.20**a 2.10±0.30 1.99±0.17 1.92±0.56 1.95±0.25 Glu/tCr 1.71±0.34 1.47±0.13 1.58±0.18 1.50±0.10 1.58±0.13 1.56±0.23 tNAA/tCr 1.16±0.09 1.15±0.06 1.16±0.11 1.12±0.05 1.20±0.11 1.17±0.09 NAA/tCr 1.08±0.07 1.02±0.10 1.10±0.13#b 1.01±0.07#b 1.09±0.11 1.06±0.05 mI/tCr 0.77±0.14 0.87±0.16 0.86±0.13 0.93±0.10*c 0.93±0.14*c 0.91±0.17*c GSH/tCr 0.30±0.07 0.34±0.12 0.33±0.19 0.35±0.09 0.35±0.08 0.26±0.05 GPC/tCr 0.21±0.03 0.18±0.09 0.22±0.03 0.23±0.02 0.25±0.03*#bc 0.23±0.05 tCho/tCr 0.21±0.03 0.22±0.03 0.22±0.03 0.23±0.02 0.25±0.03*#bc 0.23±0.05代謝物比值 對照組2周(13只)VCI-2周(12只)對照組1個月(10只)VCI-1個月(12只)VCI-3個月(12只)

圖1 A：紅色方框表示采集波譜(ROI)所放置的位置；B：顯示正常對照組大鼠的代謝物；C：顯示VCI大鼠2周時的代謝物。NAA：N-乙酰天冬氨酸；tCr：總肌酸；tCho：磷酸膽堿(PCh)及甘油磷酸膽堿(GPC)；mI：肌醇；Glx：谷氨酸及谷氨酰胺 圖2 A、B：均為VCI大鼠模型5個月時海馬CA1區(qū)病理變化(A：HE ×200；B：HE ×400)；C、D：均為VCI大鼠模型5個月時海馬區(qū)尼氏染色(C：尼氏 ×200；D：尼氏 ×400)Fig. 1 A: The red box indicates the location of the spectral ROI. Representative spectra from study rats: B: Control rats (Con). C: VCI rats at 2 weeks.NAA: N-acetylaspartate. tCr: total creatine. tCho: glycerophosphocholine + phosphocholine. mI: myo-Inositol. Glx: glutamate + glutamine. Fig. 2 A and B were the pathological changes of hippocampal CA1 region in VCI rats at 5 months (A: HE ×200. B: HE ×400). C and D were the Nissl staining of the hippocampal CA1 region at 5 months in VCI rats (C: Nissl ×200. D: Nissl ×400).

2.3 1H-MRS結(jié)果

與對照組相比，術(shù)后2周，VCI大鼠即出現(xiàn)明顯的學習記憶能力障礙，腦內(nèi)的代謝物Glu/tCr顯著下降(P=0.029)；術(shù)后1個月，NAA/tCr顯著下降(P=0.037)，而mI/tCr顯著上升(P=0.005)； 術(shù)后3個月， NAA/tCr含量有所恢復， mI/tCr (P=0.007)顯著上升，而GPC/tCr，tCho/tCr含量顯著上升(P值均＜0.05)；術(shù)后5個月，除mI/tCr仍保持在較高水平(P=0.039)外，其他代謝物均恢復至正常水平(表3；圖1)。

2.4 病理學檢查結(jié)果

HE染色可見VCI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，少數(shù)神經(jīng)元呈點狀或片狀嗜伊紅染色增強，似紅色神經(jīng)元(圖2A、B)。尼氏染色可見VCI組海馬錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體減少，染色減弱，部分錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體溶解，輪廓模糊、著色淺淡(圖2C、D)。

3 討論

3.1 應用3.0 T 1H-MRS技術(shù)獲取鼠腦波譜的可行性分析

隨著MRI技術(shù)的進步和場強的提高，臨床MRI掃描儀也能獲得高質(zhì)量的小動物MRI圖像，而且可以檢測到既往臨床MRI不能檢測到的Glu峰的變化[6]。Aradi等[7]對大鼠進行了定量MRS的研究證實了在臨床3.0 T MRI掃描儀上能可靠檢測到代謝物的含量，但該研究中由于受到人體商用表面線圈的限制，不能使用更小的體元從而不能使信噪比(signal noise ratio，SNR)進一步提高，而且并未獲得定量的1H-MRS代謝物濃度。本研究通過配置了飛利浦3.0 T Achieva系統(tǒng)兼容的小動物線圈，內(nèi)徑5 cm，含4個射頻通道，使掃描速度和分辨率得到了提高，由于感興趣區(qū)與信噪比呈正相關，因此設置的感興趣區(qū)除了海馬外，還包括部分視皮層和紋狀體，獲得了較高質(zhì)量的1H-MRS譜線。同時，本研究應用LCModel軟件進行波譜代謝物的定量檢測，使研究的準確性得到了進一步提高。此外，為了驗證1H-MRS數(shù)據(jù)的可重復性，筆者選取了6只正常大鼠，將其在2周和1個月時采集的數(shù)據(jù)納入分析，采用配對t檢驗，發(fā)現(xiàn)所有代謝物的比值在2周和1個月時差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05；表2)，證明數(shù)據(jù)具有可重復性。同時也認為動物模型的1H-MRS研究可以在3.0 T MR掃描儀上進行。

3.2 Glu對認知功能的影響

Glu是大腦，尤其是海馬內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)遞質(zhì)，它通過長時程增強效應參與記憶形成的過程[8]。Rupsingh等[9]和Westhoff等[10]的研究發(fā)現(xiàn)在AD和高血壓伴認知功能障礙的患者海馬中均存在Glu/tCr含量的下降。本實驗中VCI大鼠在術(shù)后2周出現(xiàn)明顯的認知功能障礙，表現(xiàn)為逃避潛伏期與第一次穿越平臺時間延長和穿越平臺次數(shù)減少。與此同時，與對照組相比，大鼠腦內(nèi)中Glu/tCr含量顯著的下降，結(jié)果與臨床研究結(jié)果一致。此外，Shiino等[11]也發(fā)現(xiàn)AD和SIVD (subcortical ischemic vascular dementia，SIVD)患者海馬中存在(Glu+Gln)/tCr的顯著性下降。Sun等[12]也認為中風并有腦血管病患者海馬中的(Glu+Gln)/tCr的含量參與了認知功能障礙的調(diào)控。

一方面，Glu含量的下降可能與海馬中谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)紊亂以及細胞內(nèi)的谷氨酸泄漏到細胞間隙有關，因為MRS檢測到的Glu主要來自于細胞內(nèi)。Sun等[12]認為Glu含量的下降獨立于可檢測到的組織損傷，因此，Glu含量的變化可以作為出現(xiàn)認知功能障礙的一個早期檢測指標。另一方面，Glu含量的下降可能與其參與了大腦能量代謝有關。改良的4-VO會引起大鼠雙側(cè)椎動脈永久性凝閉，導致其慢性腦血流灌注不足。在VCI術(shù)后2周，大腦供血的側(cè)支循環(huán)系統(tǒng)可能還未完善，因此，除葡萄糖作為大腦的主要供能物質(zhì)外，Glu也可以作為大腦能量代謝的底物。通常，在低血糖糖尿病患者及動物模型的MRS研究中均發(fā)現(xiàn)海馬中Glu含量有顯著性的下降[13]。因此，在VCI術(shù)后1個月以及后續(xù)的研究中，大腦供血的側(cè)支循環(huán)系統(tǒng)完善后，Glu的含量有所恢復，但低于正常水平。

3.3 mI在VCI進程中維持較高水平

肌醇是一種類糖的物質(zhì)，位于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，可以反映星形膠質(zhì)細胞對外界刺激的應激。mI/tCr比值的增高可以反映膠質(zhì)細胞增生或大腦肌醇代謝的改變[14]。與對照組相比，VCI大鼠在術(shù)后2周時，腦內(nèi)中mI/tCr比值有上升趨勢(0.87±0.16/0.77±0.14)， 在1個月時，其比值上升達到顯著性，并且在后續(xù)的3個月、5個月研究中一直處于較高水平，可以理解為mI含量的上升是膠質(zhì)細胞在應對腦缺血的一種可塑性表現(xiàn)。Yu等[15]在對慢性腦灌注不足的動物模型研究發(fā)現(xiàn)，模型4個月組的神經(jīng)纖維較2個月組的髓鞘破壞增多，同時神經(jīng)膠質(zhì)細胞增多。在對臨床的VCI病人研究中，張波等[16]的研究發(fā)現(xiàn)VCI患者顳葉中mI/tCr的比值升高，Chen等[17]也發(fā)現(xiàn)VCI患者前額葉白質(zhì)中mI/tCr比值顯著高于輕度認知患者。而樓海燕等[18]卻認為VCI患者雙側(cè)海馬中mI/tCr含量保持不變。通常大多數(shù)的研究也都認為mI/tCr比值的升高僅出現(xiàn)在AD患者的部分腦區(qū)，如海馬，頂-枕葉等，而在SIVD患者腦區(qū)中保持不變。

基于上述mI/tCr比值的不一致，推測這可能與研究者使用儀器的磁場、數(shù)據(jù)的表現(xiàn)形式有關。相對于其他代謝物，mI處于核磁譜峰重疊嚴重的區(qū)域，受波譜信噪比的影響較大，因此使用LCModel軟件的分峰擬合技術(shù)得到的mI含量相對準確。

3.4 NAA、Cho在VCI進程中的變化

NAA為大腦神經(jīng)元的標志物。一般來說，神經(jīng)退行性疾病患者海馬、后扣帶回等腦區(qū)中均存在NAA或NAA/Cr的顯著性降低。本實驗VCI術(shù)后2周，大鼠腦內(nèi)NAA/tCr比值表現(xiàn)出下降趨勢(P=0.08)，術(shù)后1個月NAA/tCr比值下降達到顯著性。Herminghaus等[19]和Shiino等[11]的研究均發(fā)現(xiàn)AD和VD患者海馬中的NAA的含量下降，Meng等[20]也發(fā)現(xiàn)中風并伴有輕度認知障礙患者海馬中也存在NAA/Cr的顯著性下降。

然而，在后續(xù)的3個月、5個月的研究中，NAA/tCr的比值卻逐漸恢復至正常水平。近年來，也有研究發(fā)現(xiàn)大腦NAA的含量是可以恢復的[13]，這可能是大腦神經(jīng)元對長期疾病刺激所做的可塑性調(diào)節(jié)，因此NAA的變化不僅可以反映神經(jīng)元的密度和生存能力，還可以作為神經(jīng)元代謝功能和完整性的動態(tài)標志。

Cho是膽堿復合物，GPC是磷酸化的膽堿，Cho或Cho/tCr的增加提示神經(jīng)膠質(zhì)增生。本研究中VCI大鼠腦內(nèi)GPC/tCr和tCho/tCr比值上升，這與Mackay等[21]研究中VD患者左側(cè)頂葉灰質(zhì)的Cho/Cr較正常對照組升高的結(jié)果類似，后扣帶回Cho的升高反映了膽堿能系統(tǒng)受損，從而引起認知功能障礙。與此不同的是，國內(nèi)樓海燕等[18]的研究卻并沒有發(fā)現(xiàn)VCI患者(mini-mental state examinatlon，MMSE=20～23分)雙側(cè)海馬的Cho/Cr與對照組的差異。但Suriyajakryuththana等[22]卻認為AD患者左前腦區(qū)存在Cho/Cr比值的下降，并推測該區(qū)域發(fā)生了神經(jīng)退行性病變而不是神經(jīng)膠質(zhì)增生。因此，關于Cho含量的變化在AD、VD的研究中并沒有一致的結(jié)論，因為在不同的病理時期，大腦的病理改變存在區(qū)域選擇性，這也提示在使用1H-MRS揭示病理變化的同時需要結(jié)合病理及免疫組化檢查的結(jié)果，從而確認代謝物變化的病理基礎。

本研究不足之處主要有：為了保證一定的信噪比，設置ROI包括海馬以及部分視皮層、丘腦以及紋狀體；改良的Pulsinelli 4-VO法制作的大鼠VCI模型后期成活率(3個月、5個月)較低(50%)；僅在實驗結(jié)束后獲取VCI大鼠的病理學資料，病理學檢查僅做了HE和Nissle染色；由于VCI組大鼠后期成活率低，VCI組大鼠在3個月、5個月時只數(shù)較少，行為學結(jié)果與MRS結(jié)果沒有顯著的相關性。以上問題將在后續(xù)的研究中改進。

綜上所述，本實驗采用3.0 T1H-MRS技術(shù)以及結(jié)合LCModel軟件對VCI大鼠模型腦內(nèi)代謝物的縱向研究具有一定的可行性，對Glu、mI等代謝物的測量更加精準。VCI大鼠在術(shù)后2周即出現(xiàn)Glu/tCr比值下降以及VCI進程中表現(xiàn)出來的mI/tCr持續(xù)升高可能有助于早期VCI的診斷。

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