趙琴玭，陳建中，胡立濤，韓文文

（湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000）

1 青錢(qián)柳的生物學(xué)特性

青錢(qián)柳產(chǎn)于長(zhǎng)江以南，廣泛分布于我國(guó)的亞熱帶地區(qū)的江西、浙江、江蘇、安徽、福建、臺(tái)灣、湖北、四川、貴州、湖南、廣西、廣東和云南等省[1,6]。它常生長(zhǎng)在海拔800～2500m的山地中，喜陰、耐寒、耐旱，要求深厚、肥沃濕潤(rùn)土質(zhì)，萌芽力強(qiáng)，生長(zhǎng)中速，但在自然狀態(tài)下發(fā)芽率低，僅為0.1%～0.2%，種子空粒率高且具有深休眠特性，一般播種后需隔年甚至2年后才萌發(fā)，很難成片生長(zhǎng)[3,7,8]。青錢(qián)柳為多年生落葉喬木，樹(shù)干通直，高達(dá)20～30m，樹(shù)木高大挺拔，樹(shù)皮灰褐色；枝葉美麗多姿，枝條呈黑褐色，具灰黃色皮孔；果實(shí)為堅(jiān)果，扁球形，直徑約7 mm，中部圍有水平方向的革質(zhì)圓盤(pán)狀翅，頂端有4枚宿存花被片及花柱，與銅錢(qián)很相似，因此也被稱(chēng)為“搖錢(qián)樹(shù)”，花期 4～5 月，果期 8～10 月[3,7,9]。奇數(shù)羽狀復(fù)葉，互生，有7～9片小葉，橢圓形或長(zhǎng)橢圓狀披針形，邊緣具細(xì)齒。花單性同株，柔荑花序下垂，雄花序2～4枚，集生于上年枝葉腋；雌花序單生當(dāng)年枝頂。其果實(shí)及果翅全部被有腺體，在基部及宿存花柱上則被有稀疏的短柔毛[10]。

2 青錢(qián)柳組培快速繁殖

無(wú)性繁殖不僅能保持母體的遺傳特性，還能解決種子休眠等問(wèn)題，目前主要的無(wú)性繁殖方式有扦插、嫁接和組織培養(yǎng)等。組織培養(yǎng)是目前最有效可行的無(wú)性繁殖途徑，除了具備繁殖快、不受場(chǎng)地、季節(jié)和環(huán)境條件限制等諸多優(yōu)點(diǎn)，還能克服常規(guī)無(wú)性繁殖速度慢、繁殖率低等缺點(diǎn)[11]。

2.1 外植體的選擇

吳群英等[12]研究表明，春季采集的莖段能夠誘導(dǎo)芽的抽生，出芽率可達(dá)29.17%；夏、秋兩季采集的莖段出芽率和出愈率都比較低，且褐變率都大于50.00%。另外，魯萌研究發(fā)現(xiàn)，4月的青錢(qián)柳莖段腋芽萌芽率為86.70%，萌芽生長(zhǎng)狀態(tài)最好，而5月份萌芽率為66.67%，但整體生長(zhǎng)狀態(tài)不如4月份理想[13]，這說(shuō)明青錢(qián)柳外植體的采取最佳時(shí)期是春季的4月份。

2.1.1 嫩葉和嫩芽。青錢(qián)柳的嫩葉、嫩芽均不能夠直接誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生，但它們產(chǎn)生愈傷組織的效果較好，出愈率都高于60%，尤其是嫩葉，出愈率可達(dá)93.33%[12]。葉片產(chǎn)生不定芽的主要部位是葉脈切口處和葉柄端切口處，首先外植體切口處細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，后通過(guò)再分化形成不定芽[14]。但大部分研究都僅獲得愈傷組織，無(wú)法進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。阮氏釧等[15]研究發(fā)現(xiàn)，從葉和莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織須經(jīng)過(guò)狀態(tài)調(diào)整后才能產(chǎn)生不定芽，但青錢(qián)柳的愈傷組織分化的不定芽難以形成完整的植株。

2.1.2 莖段。在以青錢(qián)柳莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，胡冬南等[16]研究發(fā)現(xiàn)，頂芽下1、2節(jié)的莖段分化效果較好，萌發(fā)率高，是最佳誘導(dǎo)材料。在植物組織培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)器官分化的調(diào)節(jié)起重要作用，就形態(tài)學(xué)而言6-BA能夠促進(jìn)芽的分化、側(cè)芽的生長(zhǎng)[17]。謝寅峰等[18]首次以青錢(qián)柳莖段為外植體直接誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，通過(guò)以芽繁芽的方式進(jìn)行增殖，在此試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)6-BA是誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的主要因素；其次是NAA、2ip。目前已有許多研究以青錢(qián)柳莖段為外植體，雖可成功分化、誘導(dǎo)生根[13,16,18,19]，但生根率與生根質(zhì)量未達(dá)標(biāo)、芽苗玻璃化和褐化等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。

2.1.3 離體胚。相比以青錢(qián)柳的嫩葉、莖段等為外植體，離體胚因被堅(jiān)硬種皮包裹，不易受雜菌污染，且其分化能力較強(qiáng)，所以在培養(yǎng)時(shí)污染率很低、成苗數(shù)也較多，是一種有效獲得青錢(qián)柳無(wú)菌小植株的培養(yǎng)方法[20,21]。但青錢(qián)柳種子外殼堅(jiān)硬，對(duì)種子的萌發(fā)有非常大的阻力，而要取出完整離體胚有一定的困難。尚旭嵐等[22]將青錢(qián)柳種子用濃硫酸預(yù)處理4h，剝離出離體胚進(jìn)行培養(yǎng)，采用離體胚培養(yǎng)技術(shù)使休眠期很長(zhǎng)的青錢(qián)柳種子很快萌發(fā)，并在短期內(nèi)迅速成苗。由于不同種源的種子酸蝕時(shí)間不一樣，若酸蝕時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，濃硫酸將會(huì)破壞種胚致種子無(wú)法萌發(fā)。徐慶等[23]對(duì)種子進(jìn)行酸蝕和綜合處理后直接將種子接入培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，可直接得到無(wú)菌苗進(jìn)行快速繁殖，減少了剝離種胚的操作步驟，為青錢(qián)柳快速繁殖提供了一套簡(jiǎn)便的新方法。

2.2 培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中離體材料賴(lài)以生存和發(fā)展的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，內(nèi)含碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽和水等營(yíng)養(yǎng)要素，具有維持植物細(xì)胞滲透壓、酸堿度等功能，是組培成功與否的重要因素。不同種類(lèi)植物或同種植物的不同組織以及不同培養(yǎng)階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求都有所不同，因此，在植物組織培養(yǎng)快速繁殖過(guò)程中需要選擇合適的培養(yǎng)基。

2.2.1 基本培養(yǎng)基。在以青錢(qián)柳莖段腋芽作為外植體的研究中，張志敏等[24]發(fā)現(xiàn)，在7種基本培養(yǎng)基中WPM和改良MS培養(yǎng)基最佳，誘導(dǎo)率分別達(dá)到83.33%和75.76%，其中WPM培養(yǎng)基上的植株葉深綠色、葉片伸展、莖粗壯，說(shuō)明WPM基本培養(yǎng)基最適宜青錢(qián)柳生長(zhǎng)。此外，WPM無(wú)機(jī)鹽濃度相對(duì)較低，還適于離體胚的萌發(fā)和芽苗生長(zhǎng)[25]。而胡東南等[16]認(rèn)為，莖段在改良DKW培養(yǎng)基上的分化率高，芽長(zhǎng)得快，適合青錢(qián)柳的壯苗培養(yǎng)；在改良MS培養(yǎng)基上的分化率稍低，分化所耗時(shí)間較長(zhǎng)，但能分化出較多芽數(shù)，可用作青錢(qián)柳的誘導(dǎo)分化和增殖培養(yǎng)。綜上可得，不同時(shí)期或不同取材部位的青錢(qián)柳莖段，在相同培養(yǎng)基上的分化效果不一樣，因此選擇適宜的基本培養(yǎng)基極為重要。

2.2.2 酸堿度（pH）。不同植物所適應(yīng)的pH范圍不同，培養(yǎng)基pH值是影響培養(yǎng)基凝固程度的重要因素[26,27]，此外，pH還影響植物對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，因此，在接種植物材料前必須調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。植物組織培養(yǎng)中多數(shù)植物pH值要求為5.0～6.2；一般青錢(qián)柳外植體生長(zhǎng)的適宜pH值為5.8[27,28]，然而，蔣小滿(mǎn)等[26]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基高溫滅菌后，其pH值會(huì)下降，所以在滅菌前可適當(dāng)調(diào)高培養(yǎng)基pH值0.2～0.5個(gè)單位，這樣可以確保滅菌后的pH值與原設(shè)計(jì)值接近。

磚子旁邊戴眼鏡的青年詩(shī)人問(wèn)：余老科，罵誰(shuí)呢？余科長(zhǎng)搖搖頭說(shuō)，一個(gè)莫名其妙的電話(huà)，一個(gè)莫名其妙的女人，與我聊了一通莫名其妙的廢話(huà)，不過(guò)聲音很甜，甜得我心里酥酥的，不然我早掛了。詩(shī)人勾過(guò)頭說(shuō)，是嗎？沭陽(yáng)灌南一帶的口音，聲音膩，帶著甘蔗味？我上午也接到一個(gè)陌生女人的奇怪電話(huà)，態(tài)度特好。另幾個(gè)男士先后也喊起來(lái)，我也接過(guò)一個(gè)陌生女人的電話(huà)，有說(shuō)漣水口音，有道楚州音調(diào)，有說(shuō)尾音像金湖的，也有道盱眙味更重些的。

2.3 叢生芽的誘導(dǎo)

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，據(jù)研究表明，TDZ能促進(jìn)芽的繁殖，還有利于芽的再生，TDZ是人工合成的苯基脲衍生物之一，具有很高的細(xì)胞分裂素活性，可使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間保持較高的分裂和分化能力[29,30]。

在青錢(qián)柳叢生芽增殖誘導(dǎo)時(shí)，將青錢(qián)柳外植體誘導(dǎo)出的單芽，基部切一字樣切口[31]后接種于不同濃度激素組合的增殖培養(yǎng)瓶中，發(fā)現(xiàn)最佳組合濃度為T(mén)DZ 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L，叢生芽誘導(dǎo)率最高（100%），增殖系數(shù)達(dá)7.33[18]。但從TDZ誘導(dǎo)的不定芽產(chǎn)生的植株常常表現(xiàn)出節(jié)間縮短的矮化現(xiàn)象[32]，GA3的生理作用是加速細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分裂，在大多數(shù)情況下，對(duì)已形成的器官和胚狀體的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[30,33]，針對(duì)有矮化現(xiàn)象的叢生芽，可將其切成單芽接種于添加濃度為2.0mg/L的GA3繼代培養(yǎng)基上，苗最高達(dá)4.17cm，而且苗形正常，生長(zhǎng)健壯，葉大翠綠[18]。

2.4 壯苗與生根

青錢(qián)柳是一種不定根較難發(fā)生的樹(shù)種[3]，通過(guò)不定芽途經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的試管苗沒(méi)有根端，因此必須對(duì)產(chǎn)生的再生植株進(jìn)行生根誘導(dǎo)。影響試管苗不定根發(fā)生的因素有試管苗本身的生長(zhǎng)狀態(tài)及生理年齡等，當(dāng)培養(yǎng)材料得到一定程度的復(fù)壯后，細(xì)胞分化能力提高，從而有利于生根與根的生長(zhǎng)[34]。

在青錢(qián)柳試管苗繼代培養(yǎng)過(guò)程中易出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、莖段纖細(xì)、葉片枯落等現(xiàn)象，若繼代時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)發(fā)生褐化導(dǎo)致植株壞死且移栽成活率較低。為解決這些問(wèn)題以建立完整的組培快繁體系，謝寅峰等[5]研究發(fā)現(xiàn)添加0.1mg/L烯效唑能有效抑制叢芽分化、控制苗高、增粗苗徑，適合作為增殖后的壯苗培養(yǎng)基添加劑。為促進(jìn)芽的分化、增加生物量、增高苗高，也可在增殖培養(yǎng)基中添加硝酸鑭5mg/L，起到良好的壯苗作用[35]。

生根誘導(dǎo)分為試管內(nèi)誘導(dǎo)和試管外誘導(dǎo)，謝寅峰等[5]以IBA作為生根誘導(dǎo)物質(zhì)，添加IBA 0.2mg/L培養(yǎng)2周后有不定根發(fā)生，生根率16.67%，成活率100.00%，在此基礎(chǔ)上再將其暗培養(yǎng)15 d后發(fā)現(xiàn)生根率提升至23.33%，成活率不變；而暗處理8～10d時(shí)，生根率有所下降；暗誘導(dǎo)18 d時(shí)生根率雖然達(dá)到20.00%，但成活率卻只有86.67%。由此看來(lái)，生長(zhǎng)素的代謝程度也能對(duì)生根產(chǎn)生影響，因?yàn)楣饪梢源龠M(jìn)生長(zhǎng)素的降解；同時(shí)必須把握暗誘導(dǎo)的時(shí)間，時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)抑制光合作用而使生長(zhǎng)素的代謝速率降低，使生根率降低并影響植株的正常生長(zhǎng)。

3 存在的問(wèn)題

3.1 污染問(wèn)題

在組培過(guò)程中，研究人員的操作不當(dāng)或外植體消毒不充分均會(huì)產(chǎn)生污染，使培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)和發(fā)育，而外植體消毒不充分是引起污染的主要原因。在以青錢(qián)柳莖段為外植體的試驗(yàn)中，使用正確的消毒劑及其濃度和處理時(shí)間不僅能降低污染率，還能提高外植體的萌發(fā)率。張志敏等[24]發(fā)現(xiàn)升汞處理時(shí)間過(guò)短，會(huì)造成污染嚴(yán)重；升汞處理時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)對(duì)莖段組織細(xì)胞造成傷害，因此升汞的處理時(shí)間是影響消毒效果的主要因素，而乙醇的處理時(shí)間對(duì)萌發(fā)率效果的影響最大，是誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的主要因素，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)消毒滅菌的最佳組合是70%乙醇30s+0.1%升汞12min，污染率最低（31.25%），萌發(fā)率最高（81.82%）。

3.2 褐變問(wèn)題

褐變是影響組織培養(yǎng)的重要因素，目前在許多植物組培過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有褐變現(xiàn)象且主要發(fā)生在植物外植體[36,37]。發(fā)生褐變的原因是植物體內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)被多酚氧化酶（PPO）氧化產(chǎn)生棕褐色醌類(lèi)物質(zhì)，醌類(lèi)又會(huì)在酪氨酸酶等作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，產(chǎn)生黑色或褐色的色素沉淀，同時(shí)抑制許多酶活性，進(jìn)而引起其他酶系統(tǒng)失活，使組織代謝活動(dòng)紊亂，對(duì)外植體材料產(chǎn)生毒害作用，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致培養(yǎng)材料死亡[37～40]。褐變的發(fā)生往往是多種因素同時(shí)作用的結(jié)果，引起褐變的因素主要有外植體材料的生理狀態(tài)、取材部位和大小、培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件（溫度、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度和通氣狀況等）、外加激素的含量及比例，另外轉(zhuǎn)瓶周期也會(huì)影響褐變的發(fā)生[37,39]。

由于對(duì)易于褐變的外植體材料進(jìn)行預(yù)處理和連續(xù)轉(zhuǎn)接可以減輕酚類(lèi)物質(zhì)和醌類(lèi)物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用[39]，謝寅峰等[5]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青錢(qián)柳試管苗培養(yǎng)40d時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較好且能適應(yīng)新培養(yǎng)基中的環(huán)境，因此每隔40d將外植體轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基能避免發(fā)生褐變。吳群英等[12]將外植體先于4℃預(yù)處理5d再接種，發(fā)現(xiàn)可有效降低褐變率，另外直接用燒紅的手術(shù)刀快速切割外植體后再進(jìn)行接種可使莖的褐變率由100%降至55.55%；不同時(shí)期的外植體褐變程度不同，該研究發(fā)現(xiàn)幼嫩的組織酚類(lèi)物質(zhì)含量少，在組織培養(yǎng)中較不容易出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，因此選擇幼齡材料作為外植體較合適。

有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入合適的植物生長(zhǎng)劑、抗氧化劑及吸附劑或通過(guò)下調(diào)PPO的表達(dá)也能有效地防止褐變[38,39,41,42]。

3.3 玻璃化現(xiàn)象

玻璃化指組織培養(yǎng)苗呈半透明狀、外觀(guān)形態(tài)異常的現(xiàn)象[36]。試管植物玻璃化在草本與木本植物中均有發(fā)生，據(jù)報(bào)道出現(xiàn)玻璃化苗的植物已達(dá)70多種[43]。玻璃化苗的分化能力較低，難以增殖生根成苗，移栽成活率低；通常玻璃化苗可通過(guò)重新分化恢復(fù)正常，但比例很低并且在繼代培養(yǎng)中仍然會(huì)形成玻璃化苗[36,44,45]。張金鳳[25]發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)基中糖含量由3%增加到4%時(shí)可有效克服青錢(qián)柳組織培養(yǎng)中玻璃化的現(xiàn)象；另外，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中銨離子濃度或者及時(shí)轉(zhuǎn)移、增加自然光照和控制光照時(shí)間也能避免玻璃化現(xiàn)象[36,44]。

3.4 生根問(wèn)題

青錢(qián)柳屬于難生根樹(shù)種，在對(duì)不定根發(fā)生與內(nèi)源激素的變化關(guān)系探討過(guò)程中，謝寅峰等[46]認(rèn)為外源IBA促進(jìn)內(nèi)源IAA積累進(jìn)而誘導(dǎo)和促進(jìn)發(fā)生不定根，較高的IAA/ABA、IAA/GA3值有利于不定根的啟動(dòng)和發(fā)生，但GA3可能不是影響不定根發(fā)生的關(guān)鍵因素。

張金鳳[25]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將試管苗放入滅菌后的80mg/L IBA溶液中浸蘸75min，然后轉(zhuǎn)入不含任何激素的1/4 DKW中進(jìn)行培養(yǎng)，不論是生根率、平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)方面都能達(dá)到較好的生根效果，此外，在生根培養(yǎng)前加強(qiáng)壯苗培養(yǎng)對(duì)誘導(dǎo)生根有一定的幫助。

4 總結(jié)與展望

青錢(qián)柳集藥用、材用和觀(guān)賞價(jià)值于一身，具有很好的人工資源培育和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)前景。然而青錢(qián)柳天然資源非常少，建立其組培快繁的完整體系并實(shí)現(xiàn)工廠(chǎng)化快速育苗研究是解決資源匱乏的有效途徑。目前國(guó)內(nèi)外已有成功通過(guò)組培獲得完整的青錢(qián)柳芽苗報(bào)道，但青錢(qián)柳的組織培養(yǎng)過(guò)程中仍然存在許多亟待解決的問(wèn)題。如何有效地防止褐變和提高生根率將是青錢(qián)柳組培快繁研究的主要重點(diǎn)，而以青錢(qián)柳為原材料的新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)也將是今后探索的一個(gè)重要方向。

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