付 麗，張東向，劉安奇，呂 晴，李 偉

（齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院/抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

甘草（Glycurrihiza uralensisFisch.）為豆科甘草屬多年生草本植物［1］，是最常用的藥用植物資源之一，其根莖入藥，具多種藥理活性，有廣泛的藥用和商業(yè)價值［2］。近年來國內(nèi)外市場對甘草的需求日益增加，甘草野生資源面臨過度開采和枯竭的威脅［3］，質(zhì)量和產(chǎn)量急劇下降，種質(zhì)資源遭到嚴(yán)重破壞。隨著科技的不斷發(fā)展和應(yīng)用，利用甘草組培技術(shù)進(jìn)行快繁已有大量研究。汪連海等［4］采用不同激素配比的培養(yǎng)基，以甘草無菌苗莖尖為材料進(jìn)行快繁研究，成功優(yōu)化出增殖培養(yǎng)基，建立甘草快繁體系，甘草組織培養(yǎng)技術(shù)不僅有利于繁殖、增殖和保存，而且有利于誘導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生［5］，為甘草有效成分的提取奠定基礎(chǔ)。而利用帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽具有穩(wěn)定的遺傳性［6］，魏曉雪等［7］對野生興安百里香進(jìn)行快繁研究，證明帶芽莖段為興安百里香組培的最佳外植體，因此本試驗采用甘草無菌苗的帶芽莖段為材料，將無菌苗帶芽莖段接種在不同激素含量的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，通過測量植株株高、莖節(jié)段數(shù)、真葉片數(shù)及叢生芽的增值倍數(shù)等，以確定最佳的培養(yǎng)條件，研究最佳的植物激素濃度組合，確定甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽最佳培養(yǎng)基配方，以期為甘草快繁技術(shù)的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)專家鑒定為當(dāng)年生甘草的無菌苗帶芽莖段。

1.2 方法

本試驗于2019年4月于齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院植物代謝生理研究室進(jìn)行。

1.2.1 處理方法 在無菌條件下，選擇正常生長20 d、茁壯、有節(jié)段的無菌苗，在超凈工作臺上用滅菌鑷子取出，置于事先經(jīng)高壓滅菌干燥冷卻后的濾紙上，用滅菌解剖刀和鑷子取其帶芽莖段0.7 cm，放入不同激素處理的培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶接種4個帶芽莖段，封口后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為25℃，光照2 000 lx。

1.2.2 試驗設(shè)計 根據(jù)培養(yǎng)基中6-BA、KT和NAA的濃度比進(jìn)行單因素和組合因素設(shè)計相應(yīng)適合叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中均加入30 g/L蔗糖、8 g/L瓊脂，單因素設(shè)計：①MS+6-BA（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2）mg/L；②MS+KT（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2）mg/L；組合因素設(shè)計如表1和表2所示，每組設(shè)置3個平行試驗，每瓶25 mL培養(yǎng)基。

表1 不同濃度6-BA和KT組合設(shè)計

表2 不同激素組合試驗設(shè)計

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 接種20 d后觀察帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽及愈傷組織生長情況，按照下列方法計算叢生芽增值倍數(shù)和愈傷組織誘導(dǎo)率。

叢生芽增值倍數(shù)=分化出叢生芽個數(shù)/接種帶芽莖段數(shù)量；愈傷組織誘導(dǎo)率=（形成的愈傷組織塊數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA對帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.1.1 不同濃度6-BA對帶芽莖段生長的影響 由表3可知，6-BA濃度為0.2和1.4 mg/L時均沒有叢生芽產(chǎn)生；MS+1.8 mg/L 6-BA對帶芽莖段株高影響最大，為（10.40±0.26）cm，與其他濃度存在極顯著差異；MS+1.8 mg/L 6-BA的帶芽莖段節(jié)段、節(jié)間距、真葉數(shù)分別為（5.67±1.15）節(jié)、（1.66±0.15）cm、（6.67±1.15）片，表明6-BA濃度為1.8 mg/L對甘草壯苗最為有利。

表3 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段叢生芽生長的影響

2.1.2 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響 由表4可知，MS+0.2 mg/L 6-BA沒有叢生芽產(chǎn)生；6-BA濃度為0.6 mg/L時，其叢生芽的增值倍數(shù)為2.67±0.53；MS+2.2 mg/L 6-BA叢生芽增值倍數(shù)為3.00±0.20，且每個叢生芽均有1～2片真葉，6-BA濃度在1.0～2.2 mg/L，隨6-BA濃度的升高，甘草叢生芽的增值倍數(shù)升高。

表4 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

2.1.3 不同濃度6-BA對帶芽莖段愈傷組織形成的影響 不同濃度的6-BA對甘草帶芽莖段誘導(dǎo)愈傷組織生長發(fā)育有一定影響，由表5可知，6-BA濃度在0.2和0.6 mg/L的培養(yǎng)基中，愈傷組織的生長狀態(tài)良好且褐化率分別為11.11%和33.33%，6-BA濃度在1.0～2.2 mg/L褐化率 依次為33.33%、66.67%、44.44%、55.56%；隨6-BA濃度的升高，愈傷組織有褐化趨勢；但6-BA濃度在0.2～2.2 mg/L出愈率均達(dá)到100%。

表5 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段誘導(dǎo)愈傷組織形成的影響

2.2 不同濃度KT對甘草帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

如表6所示，在本試驗所設(shè)的6個KT濃度下（0.2～2.2 mg/L）甘草帶芽莖段均沒有長叢生芽，但卻有根和愈傷組織生成。表明不同濃度的KT對甘草帶芽莖段生長發(fā)育影響較大，KT為2.2 mg/L時甘草帶芽莖段植株高度達(dá)（9.30±1.35）cm，與其他濃度存在極顯著差異；而且莖節(jié)數(shù)可達(dá)（4.75±0.71）個，與KT 1.4和1.0 mg/L存在極顯著差異，和其他濃度之間沒有顯著差異；MS+2.2 mg/L KT真葉為（5.25±1.04）片，與KT 1.0 mg/L存在極顯著差異，與其他濃度沒有顯著差異，說明KT不利于誘導(dǎo)叢生芽。

表6 不同濃度KT對甘草帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同6-BA+KT組合對帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.3.1 不同6-BA+KT組合對帶芽莖段生長的影響不同濃度的6-BA+KT對甘草帶芽莖段生長發(fā)育的影響見表7，0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT對帶芽莖段株高影響最大，株高可達(dá)（8.63±1.21）cm，莖節(jié)數(shù)也可達(dá)（4.67±0.58）個/株，同時，該組合還對提高真葉片數(shù)最為有利。但就促進(jìn)節(jié)間伸長而言，0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT的影響最大，可達(dá)為（1.90±0.23）cm。對愈傷組織誘導(dǎo)而言，0.9 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT最為有利，愈傷半徑高達(dá)（0.37±0.13）cm，因此綜合來看，0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT對甘草壯苗有利。

表7 不同濃度6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.3.2 不同6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響 由表8可見，不同6-BA和KT配比對甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽生長發(fā)育具有一定影響，0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT對叢生芽增值倍數(shù)誘導(dǎo)最高，為（2.00±0.00）倍，與0.8 mg/L 6-BA+1.2 mg/L KT存在顯著差異，與其他濃度無差異；對叢生芽高度誘導(dǎo)，為（2.78±0.37）cm；叢生芽節(jié)間距為（1.50±0.27）cm；誘導(dǎo)叢生芽真葉為（1.33±0.13）片，與其他濃度均無差異；說明0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT為誘導(dǎo)叢生芽的增值倍數(shù)較適合的濃度。

表8 不同6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

2.3.3 不同6-BA+KT組合對帶芽莖段愈傷組織形成的影響 由表9所示，不同濃度6-BA+KT對甘草帶芽莖段愈傷組織形成具有顯著影響，在6-BA+KT的5個組合中，雖然均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但長勢都不理想，愈傷組織大多都褐化趨于黑色，當(dāng)帶芽莖段接種到6-BA+KT組合培養(yǎng)基中，6 d左右?guī)а壳o段底端膨大，出現(xiàn)水樣化，愈傷組織有生長跡象，在13 d左右莖段底部有淡黃色水樣化愈傷組織，連續(xù)培養(yǎng)16 d左右愈傷偏淺褐色，最后褐化甚至變黑色。

表9 不同濃度6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段愈傷組織形成的影響

2.4 不同激素組合對甘草叢生芽增值倍數(shù)的影響

由表10可知，不同濃度的6-BA、KT和NAA及其組合對甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽有影響且存在一定差異，綜合上述試驗，適合甘草帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的平均增值倍數(shù)（≥3）的激素組合為MS+2.2 mg/L 6-BA、MS+0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，其中MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT叢生芽的平均增值倍數(shù)達(dá)到（5.00±1.61）倍。

表10 不同激素組合對甘草叢生芽增值倍數(shù)的影響

3 討論

試驗把甘草帶芽莖段分別接種在不同激素組合的培養(yǎng)基中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，僅添加6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率較高，適宜的6-BA濃度可顯著促進(jìn)叢生芽的形成，此結(jié)果與王效宇［8］在隨6-BA濃度的升高，甘草叢生芽的增值倍數(shù)升高的結(jié)論一致。高濃度的6-BA對芽生長有抑制作用，與王非等［9］在6-BA濃度對褐毛鐵線蓮帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽中，適宜的6-BA濃度促進(jìn)褐毛鐵線蓮帶芽莖段叢生芽的形成，高濃度對叢生芽生長有抑制作用的結(jié)果相一致。在僅添加KT的培養(yǎng)基中沒有叢生芽的產(chǎn)生，但對帶芽莖段的生長發(fā)育有顯著影響。本試驗在6-BA和KT組合中發(fā)現(xiàn)，隨著KT濃度的逐漸升高，叢生芽增值倍數(shù)有下降趨勢，與梁昊［10］在KT濃度升高對千層塔叢生苗生長有抑制影響，且較高濃度均會對叢生苗的生長產(chǎn)生抑制作用，甚至死亡的結(jié)論一致。在只有6-BA的培養(yǎng)基中愈傷有褐化情況，而當(dāng)加入KT之后，隨著濃度的增加愈傷組織不僅均趨于褐化而且出現(xiàn)黑色愈傷。進(jìn)一步說明在6-BA與KT組合時，同時增加6-BA和KT的濃度對愈傷組織體積的狀態(tài)沒有很大的改變，但對愈傷組織的生長狀況有抑制的趨勢［11］。

大量研究表明，適宜的生長素和細(xì)胞分裂素組合可有效誘導(dǎo)植物外植體分化與生長，于紅梅等［12］在以海沃德獼猴桃?guī)а壳o段為外植體直接誘導(dǎo)叢生芽，建立快繁體系中發(fā)現(xiàn)，不同配比生長素與細(xì)胞分裂素對叢生芽誘導(dǎo)影響顯著。試驗發(fā)現(xiàn)不同激素組合對甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽生長有不同程度的影響，在甘草外植體誘導(dǎo)分化叢生芽的生長周期內(nèi)，帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽優(yōu)化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT。莖段能否進(jìn)行芽增值受到多種因素的影響，叢生芽增殖率高低很大程度上取決于一定范圍內(nèi)細(xì)胞分裂素與生長素的配比［13］，細(xì)胞分裂素水平增高，增進(jìn)芽發(fā)育，易形成叢生芽。因此，在叢生芽的誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞分裂素和生長素的配比是非常重要的［14］。