黃 丹,陳和明,呂復(fù)兵
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室,廣東 廣州 510640)
蝴蝶蘭(Phalaenopsis)為蘭科蝴蝶蘭屬植物,原產(chǎn)于亞熱帶雨林地區(qū),本性喜暖畏寒,為附生性蘭花。其花型似蝶、色彩多樣、鮮艷多姿,花序好、花期長,廣受花卉愛好者的喜愛,素有“蘭花皇后”的美稱,在全世界廣泛栽培[1]。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭,幾乎沒有側(cè)芽萌發(fā),不能通過分株方式進行繁殖;同時蝴蝶蘭種子不含胚乳,自然條件下萌發(fā)率非常低,不能通過播種方式進行繁殖[2]。因此,以上兩種繁殖方式均不能滿足市場對蝴蝶蘭的廣泛需求。
目前,蝴蝶蘭的繁殖方法主要為無菌播種[3-4]和組織培養(yǎng)無性繁殖[5],無菌播種主要進行雜交或自交獲得種子,經(jīng)過無菌播種得到實生苗,但實生苗分離大且變異多,不能保持親本的遺傳穩(wěn)定性,花色、花期多變等;利用莖、根、葉等外植體誘導(dǎo)原球莖進行增殖并分化成苗,雖然性狀相對一致,但仍有較高的變異率,如花色不純等[6]。利用叢生芽進行蝴蝶蘭繁殖是一種從芽到芽的增殖途徑,其優(yōu)點是通過芽長芽的方式使親本的遺傳穩(wěn)定,減少變異的發(fā)生,是最有效的快速繁殖方法[7-9]。因此,本文主要針對蝴蝶蘭叢生芽組織培養(yǎng)研究進展進行綜述,旨在為蝴蝶蘭種苗規(guī)?;a(chǎn)提供依據(jù)。
譚鵬鵬等[10]及尚楊娟等[11]以花梗為外植體,對花梗腋芽進行了試驗研究,結(jié)果表明:第2節(jié)、第3節(jié)花梗有較高的萌發(fā)率,以第3節(jié)萌發(fā)率最高;并得出花?;康牡?~3節(jié)誘導(dǎo)營養(yǎng)芽成功率較高,第4和第5節(jié)靠近頂端部分成為花芽的幾率大,這可能與芽的分化部位有關(guān),花梗基部的芽主要是休眠芽,在生長激素的誘導(dǎo)刺激下容易發(fā)育成營養(yǎng)芽,但花序頂端的芽含有未完全分化的花原基,在培養(yǎng)基中比較容易誘導(dǎo)萌發(fā)為花芽[12]。劉亮等[8]在蝴蝶蘭叢生芽誘導(dǎo)試驗中也采用花梗腋芽作為外植體,將第一代誘導(dǎo)出來的新花梗芽作為叢生芽增殖的材料,增殖倍數(shù)可達5.5。
馬曉娟等[13]在蝴蝶蘭V31品種的花梗組培快繁中發(fā)現(xiàn),消毒時間對花梗腋芽的誘導(dǎo)率、褐化死亡率和污染率都有明顯影響,在0.1%氯化汞的條件下,消毒8 min的誘導(dǎo)率比消毒10 min的誘導(dǎo)率高出6.62%,且褐化率明顯偏低。付鎮(zhèn)芳等[14]在蝴蝶蘭大辣椒花梗組織快繁研究中發(fā)現(xiàn),消毒劑、消毒時間對外植體無菌處理至關(guān)重要,既要消毒干凈外植體,又不能損傷外植體的組織。其中花梗在次氯酸鈉消毒過程中,有大量細菌性、真菌性污染出現(xiàn),當消毒20 min時污染減少,但用升汞消毒時,隨著滅菌時間的增加,細菌性、真菌性污染逐漸減少,其中消毒10 min和15 min時最徹底,但消毒10 min的成活率高于15 min。然而,曾德華等[15]在滿天紅蝴蝶蘭花梗組培快繁中,用升汞消毒9~11 min時,細菌性污染出現(xiàn)較多,當消毒13~15 min時,隨時間的增加,細菌性污染減少,成功率高達85%以上。
馬曉娟等[13]在蝴蝶蘭叢生芽快速繁殖體系中,在1/2MS和MS培養(yǎng)基中,1/2MS的誘導(dǎo)率比MS高出24.94%、褐化率也明顯比MS低,而MS培養(yǎng)基褐化嚴重且發(fā)生早,表明1/2MS培養(yǎng)基更有利于外植體的誘導(dǎo)。田甜[16]將蝴蝶蘭外植體分別接種在MS、KYOTO、1/2MS 3種培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn),1/2MS培養(yǎng)基萌發(fā)率最高。但武愛龍等[17]在蝴蝶蘭大辣椒組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究中,以花寶一號為基本培養(yǎng)基,誘導(dǎo)叢生芽的最佳配方為:花寶一號+NAA 0.3 mg/L+6-BA 5.0 mg/L。
李金雨等[18]研究發(fā)現(xiàn),6-BA濃度在0.0~3.0 mg/L之間,隨著6-BA濃度的增加,蝴蝶蘭叢生芽的誘導(dǎo)率上升,且誘導(dǎo)時間縮短;但6-BA濃度在3.0~7.0 mg/L之間,隨著6-BA濃度的上升,其誘導(dǎo)時間逐漸縮短,但誘導(dǎo)率沒有明顯變化,說明當6-BA濃度在3.0 mg/L以上時,增加6-BA濃度對蝴蝶蘭叢生芽誘導(dǎo)率作用不大。因此,3.0 mg/L的6-BA對誘導(dǎo)蝴蝶蘭叢生芽是最適宜的。劉亮等[8]認為在不添加NAA的條件下,隨著6-BA濃度的增加,誘導(dǎo)率上升且誘導(dǎo)時間縮短,當6-BA 3.0mg/L時,添加少量NAA誘導(dǎo)率達100%,因此6-BA和NAA組合使用效果較好。華海霞[19]也認為NAA對芽的誘導(dǎo)影響不大,而6-BA的影響顯著,隨著6-BA濃度的上升,增殖系數(shù)變大,在6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L下效果最好。但張偉等[20]的試驗認為,在相同培養(yǎng)基的條件下,同時使用6-BA、NAA時誘導(dǎo)率比單獨使用6-BA時低,且培養(yǎng)時間長;當6-BA的濃度達到5.0 mg/L時,誘導(dǎo)率略有下降且生長較弱,表明高濃度的6-BA不適合蝴蝶蘭花梗側(cè)芽的誘導(dǎo),當單獨使用6-BA且濃度在3.0 mg/L時,誘導(dǎo)率最高。
鐘海豐等[21]設(shè)置了6種不同的芽體物理切分與擺放方式,研究結(jié)果表明:芽體不同切分與擺放方式對蝴蝶蘭叢生芽增殖具有顯著影響。芽體切除生長點后橫插,其單芽平均增殖率顯著高于其他處理,其中PSP-3(單芽切除生長點后橫插)和PSP-6(雙芽切除生長點后橫插)的單芽平均誘導(dǎo)芽數(shù)分別為6個和5.9個,而常規(guī)單芽切除2/3葉片后豎插,其單芽平均誘導(dǎo)芽數(shù)僅為3.5個。但芽體損傷和芽體大小方面,不同處理的死亡率有所不同,單芽切除2/3葉片后縱切橫插的死亡率最高、達33.3%,單芽切除生長點后橫插的死亡率次之、為23.3%。
付鎮(zhèn)芳等[14]利用蝴蝶蘭大辣椒對基本培養(yǎng)基的增殖情況進行試驗,結(jié)果表明:不同基本培養(yǎng)基對蝴蝶蘭大辣椒的增殖有明顯不同的作用,其中MS培養(yǎng)基比1/2MS更有利于不定芽的增殖,增殖系數(shù)達2.35。但武愛龍等[17]在蝴蝶蘭大辣椒組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究中得出,利用花寶一號為基本培養(yǎng)基,叢生芽增殖和分化的最佳培養(yǎng)基為:花寶一號+NAA 0.2 mg/L +6-BA 6.0mg/L,增殖系數(shù)為5.53倍。同時,在規(guī)?;N苗生產(chǎn)中,普遍利用花寶一號作為誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)基。
在蝴蝶蘭叢生芽的增殖過程中,不同濃度的6-BA具有明顯影響。馬曉娟等[13]在試驗研究中發(fā)現(xiàn),6-BA濃度為5.0 mg/L時,叢生芽生長健壯,且增殖率最高;當6-BA處于1.0 mg/L低濃度時叢生芽增殖減少,當濃度升高至5.0 mg/L增殖率逐漸上升,但6-BA濃度大于5.0 mg/L時增殖率隨濃度的上升而下降。李金雨等[18]認為隨著6-BA濃度的上升,叢生芽的芽數(shù)增多,增殖率上升,各處理間差異達到極顯著,表明6-BA對蝴蝶蘭叢生芽的增殖具有決定性影響,其中濃度為6-BA 8.0 mg/L時增殖率最高、可達304%,且叢生芽生長健壯,便于下一步的增殖及壯苗生根。當6-BA濃度高于10.0 mg/L時增殖率逐漸上升,但叢生芽生長較弱且有畸形芽出現(xiàn),不利于增殖。譚鵬鵬等[10]也認為增加6-BA的濃度,增殖率隨之上升,當6-BA濃度從5.0 mg/L上升到7.0 mg/L時增殖率達到最高,當增加到10.0 mg/L時增殖率有所下降,表明高濃度的生長激素抑制了芽的分化。
譚鵬鵬等[10]認為,在6-BA濃度相同、NAA濃度不同的條件下,其增殖系數(shù)有所不同,隨著NAA濃度的上升,增殖系數(shù)也相應(yīng)地增大,表明NAA對叢生芽的分化有促進作用。華海霞[18]在試驗中發(fā)現(xiàn),1.5~2.0 mg/L的6-BA有利于芽的增殖,濃度在2.0 mg/L時增殖效果最好;NAA對增殖作用不明顯,但低濃度的NAA具有協(xié)同作用[22],所以最佳增殖培養(yǎng)基為1/2MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。但楊海蕓等[23]和譚巍等[24]在NAA和IAA生長素對蝴蝶蘭增殖的試驗中發(fā)現(xiàn),NAA要優(yōu)于IAA且濃度在0.5 mg/L時,增殖率最高,在6-BA和KT兩種細胞分裂素中,6-BA優(yōu)于KT,在6-BA濃度為7.0 mg/L時增殖率最高。張偉等[20]也認為NAA濃度在0.5 mg/L、6-BA濃度在1.0~7.0 mg/L時,叢生芽增殖率逐漸提高,當6-BA濃度為5.0 mg/L時增殖芽數(shù)較多且生長強壯;但6-BA濃度達7.0 mg/L時增殖芽數(shù)最多,但有畸形芽出現(xiàn)。曾德華等[15]研究發(fā)現(xiàn),6-BA和NAA的最佳濃度為3.0 mg/L和0.5 mg/L或3.0 mg/L和1.0 mg/L時,增殖效果最好。侯義龍等[25]在迷你蝴蝶蘭花梗側(cè)芽組織培養(yǎng)技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn),6-BA 8.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L最適宜叢生芽的增殖??梢姡?-BA濃度過高并不能達到最好的效果,唯有6-BA、NAA在配合使用且適宜濃度下,增殖效果最為理想。
楊錄軍等[26]在蝴蝶蘭新品種鄭農(nóng)火鳳凰的組培快繁研究中發(fā)現(xiàn),影響叢生芽增殖最大的因素是6-BA,其次是腺嘌呤,然后為CM,叢生芽在1/3MS + 6-BA 2.0 mg/L +腺嘌呤3.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L + CM 100 mL/L的培養(yǎng)基上增殖效果最好。漆子鈺等[27]在蝴蝶蘭小麻雀的組培快繁研究中發(fā)現(xiàn),6-BA 8.0 mg/L + 蛋白胨0.5 mg/L增殖率最高,表明低濃度的蛋白胨有促進增殖的作用。然而,周全等[28]研究發(fā)現(xiàn),6-BA和TDZ兩種激素在蝴蝶蘭叢生芽增殖過程中,TDZ的增殖效果優(yōu)于6-BA,適于叢生芽增殖的培養(yǎng)基為1/3MS + TDZ 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖20 g/L + 瓊脂8.0 g/L + 活性炭2.0 g/L +CM 200 mL/L。
在壯苗生根培養(yǎng)過程中,不同培養(yǎng)基的生根情況不同,其中NAA是關(guān)鍵。李金雨等[18]研究結(jié)果表明,MS + NAA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁與MS + IBA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁對生根的影響沒有差異,其它處理均達極顯著差異,其中以NAA 0.5 mg/L + 10%椰子汁的培養(yǎng)基對生根的效果最好,平均生根數(shù)達3.6條。同時,試驗結(jié)果還表明,椰子汁或香蕉汁等對生根有良好的促進作用。劉亮等[8]將增殖芽轉(zhuǎn)入1/2MS + NAA 1.0 mg/L和1/2MS + IBA 0.3 mg/L培養(yǎng)基中進行壯苗生根試驗,結(jié)果表明兩種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)生根,但后者生根快,平均根數(shù)可達3.3條且生長健壯。譚鵬鵬等[10]研究發(fā)現(xiàn),在生根階段,添加香蕉泥和活性炭對生根及壯苗有明顯促進作用,香蕉泥對pH值有緩沖作用,并且含有天然的腺嘌呤等植物激素,有利于植物根系的生長。馬曉娟等[13]發(fā)現(xiàn),椰汁、香蕉泥和土豆泥能明顯影響叢生芽增殖和分化,椰汁有利于增殖并促進生根,且顯著優(yōu)于其他兩種處理,土豆泥能促進根數(shù)和葉片數(shù)的增加。張啟香等[29]認為,當6-BA與NAA的配比適當時,蝴蝶蘭的生根較多,植株長勢旺盛且健壯,其中6-BA具有細胞分裂與分化的作用,細胞分裂可以打破頂端優(yōu)勢的影響。鄭玉忠等[30]認為壯苗生根對植株的移栽成活具有重要作用,因此應(yīng)篩選激素種類并找到適宜濃度。
張和等[31]認為在蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的褐變不利于根的形成與生長,褐變是離體培養(yǎng)的無性系植物或進行組織培養(yǎng)時,從植物上切取時傷口所分泌出的酚類物質(zhì),在多酚氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變成醌類物質(zhì)所引起,且褐變率會隨著培養(yǎng)時間的延長而增加,并生成棕褐色的醌類物質(zhì),在培養(yǎng)基中逐漸擴散,同時抑制酶的活性,毒害外植體。其中活性炭具有強大的吸附能力,能吸附非極性分子和色素等大分子,減少有害物質(zhì)的形成。王立婭等[32]發(fā)現(xiàn),1%活性炭能促進生根,并能防止植物自身的酚類物質(zhì)排泌和變褐,對繁殖材料的形態(tài)發(fā)生和器官形成具有良好作用。除了活性炭能抑制Ca+的吸收和防止褐變外,檸檬酸、Vc等物質(zhì)對緩解褐化也有一定作用,而當pH值在5.4~5.5時,排的褐變物質(zhì)也相應(yīng)減少[31]。張偉等[20]發(fā)現(xiàn)添加30 mg/L檸檬酸能減少褐化且效果顯著,表明檸檬酸能有效降低褐化率、提高誘導(dǎo)率。但段文武等[33]在蝴蝶蘭組培的研究中發(fā)現(xiàn),顯著抑制褐化且對褐化影響最大的是活性炭,轉(zhuǎn)接周期對褐化的影響次之,對褐化影響從大到小分別為活性炭、轉(zhuǎn)接周期、溫度、椰子汁,其中活性炭1.0 g/L、轉(zhuǎn)接周期10 d、溫度25℃、椰子汁濃度150 mL/L,為抑制褐化的最優(yōu)組合。
對蝴蝶蘭叢生芽組織培養(yǎng)研究進展進行綜述,有利于更系統(tǒng)、更完整地了解當前取得的水平和進展情況,能夠更好、更快地為種苗生產(chǎn)提供借鑒和服務(wù)。綜合以上的分析,以花梗為外植體,通過花梗腋芽誘導(dǎo)營養(yǎng)芽成功率較高,其中第2節(jié)和第3節(jié)最好;外植體消毒滅菌時,0.1%氯化汞消毒8~15 min比次氯酸鈉效果好,但不同品種的消毒時間略有差異。在叢生芽誘導(dǎo)中,以1/2MS或花寶一號為基本培養(yǎng)基,6-BA濃度在3.0~7.0 mg/L之間,或6-BA和NAA搭配可誘導(dǎo)出叢生芽;在增殖培養(yǎng)中,6-BA或TDZ對叢生芽增殖有明顯影響,NAA在適宜濃度下配合使用,增殖效果更佳,并以MS或花寶一號為基本培養(yǎng)基;在壯苗生根中,主要以低濃度的NAA或IBA,并配以椰子汁或香蕉汁、土豆汁等有機物對壯苗生根促進作用明顯。在眾多防褐化因子中,活性炭能顯著抑制褐化且對褐化的影響最大,轉(zhuǎn)接周期對褐化的影響次之,對褐化影響從大到小分別為活性炭、轉(zhuǎn)接周期、溫度、椰子汁,其中活性炭1.0 g/L、轉(zhuǎn)接周期10 d、溫度25℃、椰子汁濃度150 mL/L為抑制褐化的最優(yōu)組合。
雖然蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的研究目前已經(jīng)取得了相當大的研究成果,但仍然存在一些問題,特別是不同品種其消毒時間、誘導(dǎo)率、增殖率、轉(zhuǎn)接周期等均有差異,因此,需要更深入、細致地對不同類型的蝴蝶蘭進行研究,找出適合自身的最佳消毒時間、培養(yǎng)基配方及轉(zhuǎn)接周期等,才能在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
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