廖桂周

[摘要]目的研究NIBP（NIK-IKKB支架蛋白）和NF-KB p65（NF-KB核轉(zhuǎn)錄因子p65）在胃癌中表達(dá)的臨床價(jià)值。方法回顧分析我院自2012年5月～2015年5月以來(lái)實(shí)施手術(shù)切除治療的87例胃癌患者臨床資料，對(duì)胃癌標(biāo)本、癌旁組織、正常組織進(jìn)行免疫組化染色，分別以熒光PCR定量法、Western blot法檢測(cè)NIBP、NF-KB p65的表達(dá)情況。結(jié)果胃癌組織NIBP、NF-KB p65 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)、免疫組化表達(dá)陽(yáng)性率與癌旁組織、正常組織對(duì)比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論胃癌組織中NIBP、NF-K B p65均呈高表達(dá)狀態(tài)，減少NF-KB p65轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活、抑制NIBP表達(dá)，可作為治療胃癌切入點(diǎn)的依據(jù)，進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

[關(guān)鍵詞]NIK-IKKB；支架蛋白；核轉(zhuǎn)錄因子；胃癌；表達(dá)；臨床意義

NIBP（NIK-IKKB支架蛋白）是一種自人腦細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的特異性轉(zhuǎn)錄蛋白，能夠與IKKB（I-kB蛋白激酶）、NIK（NF-kB誘導(dǎo)激酶）結(jié)合而發(fā)揮作用。研究顯示，NIBP屬于TRAPPC9基因編碼，為1246個(gè)氨基酸所組成的一條多肽鏈，保守性極高。目前，腫瘤形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸與NIBP的相關(guān)性報(bào)道并不多見(jiàn)。但近年來(lái)有研究指出，結(jié)腸癌組織可見(jiàn)NIBP表達(dá)增高，并且與NF-KB的活化具有密切關(guān)系。本研究回顧分析我院自2012年5月～2015年5月以來(lái)實(shí)施手術(shù)切除治療的87例胃癌患者臨床資料，旨在研究NIBP（NIK-IKK B支架蛋白）和NF-K B p65（NF-K B核轉(zhuǎn)錄因子p65）在胃癌中表達(dá)的臨床價(jià)值，以期尋找胃癌合理化、規(guī)范化治療方案的新切入點(diǎn)，為臨床提供進(jìn)一步理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1一般資料

我院自2012年5月～2015年5月以來(lái)實(shí)施手術(shù)切除治療的87例胃癌患者臨床資料，其中男81例，女6例，年齡最大81歲，最小32歲，平均（58.3±4.2）歲。入選患者均簽署治療、臨床研究知情同意書(shū)，標(biāo)本均通過(guò)病理證實(shí)確診系胃癌，且取標(biāo)本前均未進(jìn)行放化療治療。其中距癌灶邊緣10em以上切取胃組織標(biāo)本為正常組織，距癌灶邊緣5cm以上、10cm以?xún)?nèi)切取胃組織標(biāo)本為癌旁組織。胃組織標(biāo)本切去后將一部采用多聚甲醛（4.0%）固定、脫水，經(jīng)透明及浸蠟包埋后，制成連續(xù)切片（厚4um）分別予以免疫組化、HE染色。其余標(biāo)本置于-70℃液氮內(nèi)保存，分別完成熒光PCR定量及Western blot檢測(cè)。

1.2材料與試劑

NIBP兔抗人多克隆抗體（德國(guó)拜耳），NF-kBp65兔抗人多克隆抗體（德國(guó)拜耳），HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記IgG2005山羊抗鼠（德國(guó)拜耳）、HRP標(biāo)記IgG2004山羊抗兔（德國(guó)拜耳）；SYBREX Premix TaqⅡ、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAiso Plus（美國(guó)輝瑞）；免疫組化DAB顯色劑、sP即用型試劑盒（北京泰諾）；ECL試劑盒（北京泰諾）；蛋白BCA測(cè)定、提取試劑盒（北京泰諾）。

1.3免疫組化染色

SP免疫組化染色采用檸檬酸（0.01mol/L）先予5min熱修復(fù)，以正常的山羊血清進(jìn)行封閉后，再滴加抗NF-KBp65及抗NIBP一抗，于37℃環(huán)境下1h孵育，之后步驟參考試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陰性對(duì)照以PBS來(lái)代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照均系試劑盒的廠家所提供。如胞核、胞質(zhì)有藍(lán)褐色、藍(lán)色顆粒出現(xiàn)判定為染色陽(yáng)性（如圖1～6所示），對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、染色強(qiáng)度予半定量分析。陽(yáng)性細(xì)胞70%以上計(jì)3分、41.0%-70.0%計(jì)2分、10.0%～40.0%計(jì)1分、10.0%以下計(jì)0分。染色強(qiáng)度藍(lán)褐色計(jì)3分、深藍(lán)色計(jì)2分、藍(lán)色計(jì)1分、不著色計(jì)0分。上述兩項(xiàng)評(píng)分2分以上為陽(yáng)性、2分以下為陰性。

1.4熒光PCR定量

分別切取正常胃組織、癌旁組織、胃癌組織各50mg，以TRIzol法進(jìn)行總RNA抽提，依據(jù)試劑盒說(shuō)明操作。將反轉(zhuǎn)錄RNAlug合成eDNA，再予實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。NF-KBp65及NIBP反應(yīng)條件相同，先于95℃環(huán)境下進(jìn)行30s預(yù)變性，分別于95℃環(huán)境下5s及60℃環(huán)境下30s，循環(huán)40次。各反應(yīng)管內(nèi)到達(dá)熒光信號(hào)的域值循環(huán)數(shù)35以上為陰性表達(dá)，35以下、15以上即陽(yáng)性表達(dá)。各基因樣品均設(shè)置重復(fù)擴(kuò)增管3個(gè)，內(nèi)參GAPDH，雙Delta ct定量分析。見(jiàn)表1。

1.5Western blot法檢測(cè)

以常規(guī)方法完成組織蛋白的提取后，以BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將變性后蛋白60ug予聚丙烯酰胺10%凝膠內(nèi)電泳，于冰浴下進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)，獲得PVDF（聚偏氟乙烯）膜后，以脫脂奶粉（5.0%）對(duì)非特異性抗原進(jìn)行封閉。分別將NIBP兔抗人多克隆抗體、NF-kc B p65兔抗人單克隆抗體一抗加入，于4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。以含TBST（Tween20、0.1%）進(jìn)行洗膜，再加入二抗（被HRP標(biāo)記），于室溫下進(jìn)行1h孵育。完成洗膜后，再加入ECL Plus化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)底物，于x線曝光下常規(guī)顯影。以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

選擇SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)予以統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用f檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1胃癌組織及周?chē)M織NIBP、NF-KB p65 mRNA表達(dá)情況

胃癌組織NIBP、NF-K B p65 mRNA表達(dá)水平與癌旁組織、正常組織對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2胃癌組織及周?chē)M織NIBP、NF-KB p65蛋白表達(dá)情況

胃癌組織NIBP、NF-K B p65蛋白表達(dá)水平與癌旁組織、正常組織對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.3胃癌組織及周?chē)M織NIBP、NF-KB p65免疫組化表達(dá)陽(yáng)性率

胃癌組織NIBP、NF-K B p65免疫組化表達(dá)陽(yáng)性率與癌旁組織、正常組織對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

3.討論

NF-kB（核轉(zhuǎn)錄因子）是廣泛存在于哺乳動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞核內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化，對(duì)腫瘤患者病程進(jìn)展、預(yù)后都具有非常重要的臨床意義。文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌細(xì)胞及其病變組織中NF-kB被異常激活，經(jīng)經(jīng)典、非經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，可以使NF-K B關(guān)鍵酶NIK、IKK B形成三聚體結(jié)構(gòu)的支架蛋白。另?yè)?jù)研究顯示，NIBP能夠使TNF-a（腫瘤壞死因子）所誘導(dǎo)經(jīng)典N(xiāo)F-K B轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)激活。因此，NF-K B轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的NF-K B p65表達(dá)、NIBP表達(dá)與胃癌的關(guān)系，可能對(duì)胃癌治療切入點(diǎn)具有重要意義。

近年來(lái)已有文獻(xiàn)報(bào)道NIBP在結(jié)腸癌中的表達(dá)，與結(jié)腸癌臨床分期、浸潤(rùn)深度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均有密切關(guān)系，其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者或晚期姑息治療者，NIBP表達(dá)陽(yáng)性率顯著增高。而在本文結(jié)果中，胃癌組織NIBP表達(dá)與癌旁組織、正常胃組織對(duì)比，均有明顯差異，呈增高表現(xiàn)。這說(shuō)明胃癌發(fā)生可能與NIBP水平具有密切關(guān)聯(lián)，對(duì)胃癌治療切人點(diǎn)具有重要意義。

靜息時(shí)NF-kB可呈無(wú)活性前體狀態(tài)于細(xì)胞胞質(zhì)中存在，如被激活則可引發(fā)存活蛋白、細(xì)胞周期D1蛋白、金屬基質(zhì)蛋白酶、bcl-2等靶基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制凋亡作用，加速正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤血管的生成甚至腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，對(duì)惡性腫瘤病程進(jìn)展、預(yù)后都有較大影響。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人胃正常組、胃癌旁組織、胃癌組織中NF-kB p65表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，并且胃癌病理分期、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移情況與NF-kB p65表達(dá)均有密切關(guān)系。在本文結(jié)果中，NF-K B p65在胃癌組織中的表達(dá)較正常胃組織、癌旁組織均有明顯差異，呈高表達(dá)狀態(tài)，說(shuō)明胃癌發(fā)生、病程進(jìn)展與NF-kB p65表達(dá)具有非常密切的關(guān)系，對(duì)胃癌治療切入點(diǎn)也具有重要意義。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NIBP呈高表達(dá)狀態(tài)，能夠使IKK B、NF-K B p65的磷酸化加速，對(duì)NF-K B轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起到激活劑效果。盡管IKKa表達(dá)增強(qiáng)能夠抑制IKKB的磷酸化，但NIBP呈高表達(dá)狀態(tài)下，NF-K B p65的磷酸化也隨之加速，說(shuō)明IKK B功能在此由NIBP補(bǔ)充，所以NIBP是通過(guò)對(duì)NF-kB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，干預(yù)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。另?yè)?jù)研究顯示，小鼠腸道NIBP表達(dá)增加后，NF-K Bp65轉(zhuǎn)錄隨即被激活，主要是NIBP表達(dá)受shRNA抑制，從而使NF-KB p65的激活受到抑制。所以，NF-KB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中NIBP具有至關(guān)重要的作用。

綜上所述，胃癌組織中NIBP、NF-KB p65均呈高表達(dá)狀態(tài)，而減少NF-kB p65轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活、抑制NIBP表達(dá)，可作為治療胃癌切入點(diǎn)的依據(jù)，進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。