管國(guó)強(qiáng)，崔鵬景，宋慶春，王源，何素，黃達(dá)明

(1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212009)

枯草芽孢桿菌ZC1高密度培養(yǎng)的條件優(yōu)化

管國(guó)強(qiáng)1，崔鵬景2*，宋慶春1，王源1，何素1，黃達(dá)明1

(1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212009)

在搖瓶發(fā)酵條件下，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其活菌數(shù)。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，確定了枯草芽孢桿菌ZC1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕粉24 g/L、葡萄糖6 g/L、氯化鈉8 g/L；發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度37 ℃、初始pH 7.5、接種量4%、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。在此條件下，發(fā)酵24 h，枯草芽孢桿菌ZC1的活菌數(shù)由原來(lái)的1.13×1010cfu/mL提高到3.69×1010cfu/mL。

枯草芽孢桿菌；響應(yīng)面；活菌含量

枯草芽孢桿菌呈桿狀，很少成鏈，染色均勻，鞭毛側(cè)生，芽孢0.8 μm×1.5 μm～1.8 μm游離狀態(tài)的芽孢表面著色弱，萌發(fā)時(shí)芽孢殼赤道裂[1]。由于枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境耐受能力強(qiáng)，且具有微生物普遍存在的遺傳可操作性等優(yōu)點(diǎn)，所以成為一種常用的工業(yè)模式菌，在調(diào)味品行業(yè)、發(fā)酵、植物病害防治、養(yǎng)殖業(yè)、微生態(tài)制劑及醫(yī)學(xué)上都有廣闊的應(yīng)用前景[2-4]。在調(diào)味品行業(yè)枯草芽孢桿菌應(yīng)用比較廣泛，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酶可以用于制作淀粉糖、味精、檸檬酸、氨基酸等調(diào)味品及食品添加劑。

本課題組前期在實(shí)驗(yàn)室保藏的芽孢桿菌中篩選出一種高產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌ZC1，用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸等調(diào)味品及食品添加劑。為了提高枯草芽孢桿菌ZC1中性蛋白酶的產(chǎn)量，首先需要提高種子液中枯草芽孢桿菌ZC1的活菌含量。目前，提高枯草芽孢桿菌活菌含量，主要是通過培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化及發(fā)酵罐補(bǔ)料調(diào)控培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。如張麗霞等[5]對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使得發(fā)酵液中菌含量從0.6×109cfu/mL提高到1.18×1010cfu/mL。賈鈞輝等[6]用7 g/L發(fā)酵罐對(duì)枯草芽孢桿菌B579進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度下降到3 g/L時(shí)，進(jìn)行流加葡萄糖至濃度3～6 g/L，控制pH為7.0，發(fā)酵24 h，菌含量高達(dá)3.9×1010cfu/mL，是分批發(fā)酵的7.5倍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌ZC1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院409實(shí)驗(yàn)室保藏。

豆粕粉 菜場(chǎng)購(gòu)得；葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

YC-L型冷凍恒溫振蕩器 鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；立體式全自動(dòng)高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司；MP5002電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；101-2A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠；快速混勻器 江蘇中大儀器廠。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L。

1.2.2 斜面培養(yǎng)基

大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L。

1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

豆粕粉20 g，蒸餾水 1000 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 活菌菌含量測(cè)定

枯草芽孢桿菌ZC1活菌菌含量的測(cè)定采用稀釋涂布平板法[7]。

1.3.2 枯草芽孢桿菌ZC1的活化及種子液的制備

將枯草芽孢桿菌ZC1轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，備用。在斜面上挑取2環(huán)活化后的枯草芽孢桿菌ZC1，接入初始pH為7.2的種子液中，裝液量為50 mL/250 mL，在37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上培養(yǎng)18 h。

1.3.3 枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

配制15組種子培養(yǎng)基，裝液量統(tǒng)一為50 mL/250 mL，分別編號(hào)1～15。向1～15號(hào)種子培養(yǎng)基中各加入2環(huán)枯草芽孢桿菌，搖勻。發(fā)酵條件同上，在搖床上培養(yǎng)30 h。此后，每隔2 h測(cè)種子培養(yǎng)基的OD值(600 nm)，以下簡(jiǎn)稱OD600，即在培養(yǎng)第2 h，測(cè)1號(hào)種子培養(yǎng)基的OD600；在培養(yǎng)第4 h，測(cè)2號(hào)種子培養(yǎng)基的OD600；以此類推，直到測(cè)完培養(yǎng)30 h，第15號(hào)培養(yǎng)基的OD600。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、甘油，以不加碳源為空白。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，在接種量4%、發(fā)酵液初始pH 7.2，裝液量50 mL/250 mL，發(fā)酵溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下，發(fā)酵24 h后檢測(cè)發(fā)酵液中的活菌含量，確定最佳碳源。

1.3.4.2 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

確定最佳碳源后，向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%最佳碳源以及分別添加0.6%的氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳，以不加無(wú)機(jī)鹽為空白。采用搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵條件同上，發(fā)酵24 h后檢測(cè)發(fā)酵液中的活菌含量，確定最佳無(wú)機(jī)鹽。

1.3.4.3 不同豆粕粉、葡萄糖及氯化鈉濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由上述實(shí)驗(yàn)確定最佳碳源為葡萄糖，最佳無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉。隨后采用濃度梯度方法，發(fā)酵條件一致，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h后檢測(cè)發(fā)酵液中的活菌含量，確定各組分最佳濃度。豆粕粉濃度分別為12，16，20，24，28，32 g/L，葡萄糖濃度分別為2，6，10，14，18 g/L，氯化鈉濃度分別為3，6，9，12，15 g/L。

1.3.5 最陡爬坡試驗(yàn)

以適當(dāng)?shù)奶荻雀淖兌蛊煞?、葡萄糖、氯化鈉在培養(yǎng)基中的濃度，考察菌含量的變化趨勢(shì)，確定最適濃度范圍。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1菌含量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平以及編碼見表1。對(duì)得到的組合進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 枯草芽孢桿菌ZC1發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.7.1 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

將接好種子液的培養(yǎng)基分別置于28，31，34，37，40 ℃的搖床中，培養(yǎng)24 h，檢測(cè)其菌含量，其他發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH 7.2，接種量4%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。

1.3.7.2 pH對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)為6.5，7，7.5，8，8.5，同樣接入4%的種子液，在37 ℃，180 r/min搖床上，培養(yǎng)24 h，檢測(cè)其菌含量。

1.3.7.3 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

向初始pH為7.2的培養(yǎng)基中分別接入2%，4%，6%，8%，10%的種子液，在37 ℃，180 r/min的搖床上，培養(yǎng)24 h，檢測(cè)其菌含量。

1.3.7.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

向初始pH為7.2的培養(yǎng)基中接入4%的種子液，37 ℃條件下，分別在轉(zhuǎn)速50，100，150，200，250 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，檢測(cè)其菌含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌ZC1的生長(zhǎng)曲線

微生物的生長(zhǎng)一般分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期以及衰亡期[8]。

圖1 枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，枯草芽孢桿菌ZC1延滯期較短，在0～2 h，枯草芽孢桿菌ZC1數(shù)量較少；在2～10 h，枯草芽孢桿菌ZC1進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，菌含量急速增加；在12～24 h，枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，細(xì)胞活力較高，在24 h左右時(shí)菌含量達(dá)到最高。之后隨著培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分減少，有害代謝物增多，菌種慢慢進(jìn)入衰亡期。由此可知，選擇16～24 h時(shí)的菌液進(jìn)行接種較為合適。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

碳源在枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)過程中起著至關(guān)重要的作用，為其生長(zhǎng)代謝提供能量[9]。

圖2 不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，選用玉米粉和甘油作為碳源對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1的菌含量提高不明顯。而采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源，菌含量都達(dá)到了2.5×1010cfu/mL左右。這從一定角度說(shuō)明枯草芽孢桿菌ZC1直接利用單糖以及二糖優(yōu)于玉米粉和醇類碳源，而在單糖和二糖中，枯草芽孢桿菌ZC1利用葡萄糖能力最佳。

2.2.2 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

無(wú)機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)因子，可維持生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在微生物生長(zhǎng)過程中起著重要的作用[10]。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂這幾組與空白組的枯草芽孢桿菌ZC1含菌量差距不大，說(shuō)明這幾種鹽對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)影響不大，而氯化鈉對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。另外，硫酸錳這組菌含量只有空白組的30%左右，不利于枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)，這是由于硫酸錳有助于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生芽孢，抑制了枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)。

2.2.3 不同豆粕粉濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

豆粕粉濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響見圖4，當(dāng)豆粕粉濃度為24 g/L時(shí)，枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)情況最好，菌含量達(dá)到了3.14×1010cfu/mL。

圖4 不同豆粕粉濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，豆粕粉過高或過低，枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)都會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析其中原因，當(dāng)豆粕粉濃度過低時(shí)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分不足，不利于菌種生長(zhǎng)；當(dāng)濃度偏高時(shí)，使得發(fā)酵液變得粘稠，溶氧下降，也會(huì)抑制菌種生長(zhǎng)。

2.2.4 不同葡萄糖濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

圖5 不同葡萄糖濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，不同葡萄糖濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)具有較大影響，當(dāng)葡萄糖濃度為6 g/L時(shí)，菌種生長(zhǎng)較好，而濃度或高或低，都會(huì)對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。這可能是因?yàn)槠咸烟菨舛冗^低，使得培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)不夠，不利于菌種生長(zhǎng)；濃度過高，使得培養(yǎng)基滲透壓過高，從而導(dǎo)致枯草芽孢桿菌脫水，抑制其生長(zhǎng)。

2.2.5 不同氯化鈉濃度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

圖6 不同氯化鈉濃度對(duì)枯草芽孢生長(zhǎng)ZC1的影響

由圖6可知，當(dāng)氯化鈉為6 g/L左右時(shí)，枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)狀況最好，氯化鈉濃度或高或低，枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)都會(huì)呈現(xiàn)較小趨勢(shì)的下滑。這可能是因?yàn)槁然c濃度過高，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中的滲透壓偏高，菌體細(xì)胞容易脫水，抑制枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定各組分的最適濃度范圍，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表2可知，隨著豆粕粉、葡萄糖和氯化鈉濃度逐步提高，枯草芽孢桿菌ZC1的菌含量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)豆粕粉為24 g/L，葡萄糖為6 g/L，氯化鈉為6 g/L時(shí)，菌含量最高，達(dá)到了3.48×1010cfu/mL。由此，可以采用此濃度作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，確定了豆粕粉、葡萄糖及氯化鈉這3個(gè)因素。根據(jù)正交設(shè)計(jì)原理，選擇這3個(gè)因素作為自變量，以枯草芽孢桿菌ZC1菌含量為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。其他發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度37 ℃，裝液量為50 mL/250 mL，初始pH 7.2，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量4%。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知，豆粕粉、葡萄糖和氯化鈉對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1菌含量影響的主次因素為A>B>C，其中當(dāng)豆粕粉含量為20～28 g/L時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌菌含量影響較為顯著；豆粕粉含量在24 g/L時(shí)，枯草芽孢桿菌菌含量最高；氯化鈉在4～8 g/L之間時(shí)，對(duì)菌含量影響不大。根據(jù)極差值，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A2B2C3。培養(yǎng)基組成：豆粕粉24 g/L、葡萄糖6 g/L、氯化鈉8 g/L。在此條件下，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，分別測(cè)得枯草芽孢桿菌菌含量為3.48×1010，3.52×1010，3.60×1010cfu/mL，平均菌含量為3.53×1010cfu/mL，證明正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的豆粕培養(yǎng)基具有一定指導(dǎo)意義。

2.5 枯草芽孢桿菌ZC1發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖7可知，發(fā)酵溫度在枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖過程中起到至關(guān)重要的作用?？莶菅挎邨U菌ZC1在發(fā)酵溫度為28～40 ℃，培養(yǎng)24 h，活菌含量較穩(wěn)定，隨著溫度變化，菌含量先增高后降低，其中發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，菌含量最高，達(dá)到了3.49×1010cfu/mL。

2.5.2 不同初始pH對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

圖8 初始pH對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖8可知，枯草芽孢桿菌ZC1的初始pH值為7.0～8.0時(shí)，生長(zhǎng)較為穩(wěn)定；當(dāng)初始pH為7.5左右時(shí)，最適枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)增殖，菌含量達(dá)到3.59×1010cfu/mL。pH值過高或過低都不利于枯草芽孢桿菌ZC1的生長(zhǎng)。

2.5.3 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

圖9 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖9可知，當(dāng)接種量為4%時(shí)，枯草芽孢桿菌ZC1菌含量最高，并非接種量越高，菌含量越高，這可能是由于接種量過高，發(fā)酵前期發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，引起菌種的提前衰亡，不利于枯草芽孢桿菌ZC1的高密度培養(yǎng)。

2.5.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

圖10 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1生長(zhǎng)的影響

由圖10可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速增高，枯草芽孢桿菌ZC1菌含量先增高后降低，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，枯草芽孢桿菌菌含量最優(yōu)，達(dá)到3.62×1010cfu/mL。分析其原因，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過低，導(dǎo)致通氣量偏低時(shí)，搖瓶底部的菌種供氧不足，抑制其生長(zhǎng)；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過快時(shí)，導(dǎo)致發(fā)酵液內(nèi)部剪切力偏大，引起菌種機(jī)械損傷，不利于生長(zhǎng)。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用上述優(yōu)化得到的高密度培養(yǎng)條件，培養(yǎng)枯草芽孢桿菌ZC1，發(fā)酵24 h，檢測(cè)發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌ZC1的活菌含量，3個(gè)平行組的菌含量分別為3.72×1010，3.58×1010，3.76×1010cfu/mL，平均值為3.69×1010cfu/mL?？梢钥闯霭l(fā)酵液中枯草芽孢桿菌ZC1的活菌含量明顯提高，是優(yōu)化前的3.5倍。

3 結(jié)論

本文考察了不同營(yíng)養(yǎng)因子和發(fā)酵條件對(duì)枯草芽孢桿菌ZC1高密度培養(yǎng)的影響。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定了枯草芽孢桿菌ZC1高密度培養(yǎng)的條件為豆粕粉24 g/L，葡萄糖6 g/L，氯化鈉8 g/L，發(fā)酵溫度37 ℃，初始pH 7.5，接種量4%，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。在此條件下培養(yǎng)24 h，枯草芽孢桿菌ZC1活菌含量高達(dá)3.69×1010cfu/mL，大大提高了其活菌數(shù)，對(duì)后續(xù)中性蛋白酶酶解蛋白質(zhì)生產(chǎn)氨基酸等調(diào)味品及食品添加劑有比較重要的意義。

[1]劉秀文.芽孢桿菌生物學(xué)及其應(yīng)用[M].開封：河南大學(xué)出版社,2007.

[2]王曉閣.枯草芽孢桿菌研究進(jìn)展與展望[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)·醫(yī)學(xué)版),2012,33(3):14-22.

[3]Rao M B,Tanksale A M,Ghatge M S,et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews:MMBR,1998,62(3):597-635.

[4]王葦,秦瑤,李爽,等.枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(11):217-220.

[5]張麗霞,李榮禧,王琦,等.枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國(guó)生物防治,2006,22(增刊):82-88.

[6]賈鈞輝,鄭宇,楊青娟,等.生防枯草芽孢桿菌B579補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,44(1):35-39.

[7]杜連祥.工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社,1992.

[8]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京:高等教育出版社,1993.

[9]姚剛,程建軍,孫鵬,等.枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶研究[J].食品科學(xué)，2009,30(23):347-351.

[10]張怡,童應(yīng)凱,黃亮,等.無(wú)機(jī)鹽對(duì)地衣芽孢桿菌發(fā)酵廚余物產(chǎn)蛋白的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(15):40-41.

Optimization of High-density Cultivation Conditions ofBacillussubtilisZC1

GUAN Guo-qiang1, CUI Peng-jing2*, SONG Qing-chun1, WANG Yuan1, HE Su1, HUANG Da-ming1

(1.School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2.Zhenjiang Green Bio-Engineering Co., Ltd., Zhenjiang 212009, China)

By shake flask fermentation, in order to increase the viable count ofBacillussubtilisZC1, the fermentation medium and conditions ofBacillussubtilisZC1 are optimized by single factor experiment and response surface methodology. According to the single factor experiment and response surface methodology, the optimal fermentation medium and conditions are as follows: soybean meal is 24 g/L, glucose is 6 g/L, sodium chloride is 8 g/L, fermentation temperature is 37 ℃, initial pH is 7.5, inoculation amount is 4%, shaking speed is 200 r/min. Being fermented for 24 h, the viable count ofBacillussubtilisZC1 is increased from 1.13×1010cfu/mL to 3.69×1010cfu/mL under such conditions.

Bacillussubtilis;response surface; viable count

2016-07-15 *通訊作者

管國(guó)強(qiáng)(1975-)，男，安徽巢湖人，助理研究員，研究方向：生物工程。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.004

1000-9973(2017)01-0013-05