周敏，袁美蘭，陳麗麗，趙利，吳朝朝，金達麗

(江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心，南昌 330013)

淡水魚加工副產(chǎn)物低鹽魚露生化特性的研究

周敏，袁美蘭，陳麗麗，趙利*，吳朝朝，金達麗

(江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心，南昌 330013)

以淡水魚加工副產(chǎn)物為原料，采用分段加鹽，后期添加耐鹽醬油酵母的方法生產(chǎn)魚露，并對其生化特性進行研究。結果表明：在發(fā)酵過程中，氨基酸態(tài)氮(AA-N)、可溶性總氮(TSN)、總酸和揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的含量先上升后逐漸下降，賦香發(fā)酵后顯著下降；pH先顯著下降，隨后基本保持不變；食鹽含量在發(fā)酵過程中略有上升；活菌數(shù)和混合蛋白酶的活力在發(fā)酵過程中變化較復雜；在發(fā)酵過程中游離氨基酸的含量先增加后略有降低，賦香發(fā)酵后顯著降低。

淡水魚加工副產(chǎn)物；低鹽魚露；發(fā)酵；生化特性

魚露又稱為魚醬油、蝦油，是我國沿海地區(qū)及日本、東南亞各國人們所喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品[1]。傳統(tǒng)的魚露是以低值的魚蝦為原料，利用魚體內所含的蛋白酶和其他酶，以及多種微生物共同作用下發(fā)酵而成[2]。由于傳統(tǒng)的魚露含鹽量比較高，所以近年來低鹽魚露的生產(chǎn)工藝已經(jīng)成為人們研究的熱點。

我國是淡水魚生產(chǎn)大國，每年淡水魚的加工會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，目前我國淡水魚加工副產(chǎn)物主要用于生產(chǎn)動物飼料和直接丟棄，這不僅造成了環(huán)境問題，而且浪費了蛋白質資源。本文以淡水魚加工副產(chǎn)物為原料，采用現(xiàn)代生物技術和酶工程技術來生產(chǎn)魚露，同時在工藝上運用了分段加鹽法，在發(fā)酵后期添加耐鹽醬油酵母生產(chǎn)魚露，并對魚露的生化特性進行了研究。因此，對淡水魚加工副產(chǎn)物低鹽魚露風味的研究有利于魚露生產(chǎn)的標準化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡水魚加工副產(chǎn)物(水分76.56%，蛋白質8.65%，灰分7.98%，脂肪8.32%)：來源于江西鄱陽湖水產(chǎn)食品有限公司，平板凍結后送到實驗室，-18 ℃冷凍保存，使用前在10 ℃以下進行流水解凍。

3.042 醬油曲 北京釀造所；風味蛋白酶 丹麥諾維信有限公司；耐鹽醬油酵母 安琪酵母股份有限公司；平板瓊脂計數(shù)培養(yǎng)基 青島高科園海博生物有限公司；干酪素(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

HA-300MD型高壓滅菌器 Hirayama Manufacturing Corporation；BHC 1000ⅡA/B3型生物安全柜 蘇州安泰空氣技術有限公司；Stomacher 400均質機 英國Seward公司；Waters-2695高相液相色譜儀 美國Waters有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚露樣品的制備方法

按照吳朝朝[3]的最佳優(yōu)化工藝條件生產(chǎn)魚露。魚露發(fā)酵醪液包括淡水魚加工副產(chǎn)物低鹽自溶水解物、醬油曲20%(醬油曲/漿，W/W)，蛋白酶添加量0.1%(酶/漿，W/W)，加水比0.25∶1(水/漿，W/W)，食鹽5%。調節(jié)發(fā)酵醪液的初始pH為6.0，將500 mL混合發(fā)酵物裝于1000 mL 燒杯中，燒杯口使用兩層保鮮膜封口。將燒杯置于50 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，在發(fā)酵期間早晚各攪拌1次，發(fā)酵25天后將魚露樣品于90 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后于5000 r/min 離心15 min，過濾，再添加醬油酵母0.584%(酵母/魚露，V/V)，置于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中賦香發(fā)酵7天。對樣品進行各種指標分析，于發(fā)酵第1，5，10，15，20，25，32天取樣分析。測蛋白酶活力時，離心、過濾后不經(jīng)過滅菌操作；微生物檢測時也不經(jīng)過滅菌操作且在無菌條件下采樣。

1.3.2 pH的測定

pH的測定直接采用pH計法。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮、總酸的測定

氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法[4]：取稀釋樣品20 mL，加入60 mL水，用0.05 mol/L NaOH滴定到pH 9.6，記錄消耗的體積來確定樣品中總可滴定酸，然后加10 mL 37%的甲醛溶液，繼續(xù)滴定到pH 9.2，記錄總消耗的體積來確定甲醛態(tài)氮的含量。

1.3.4 可溶性總氮的測定

可溶性總氮的測定采用凱氏定氮法[5]。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮的測定

揮發(fā)性鹽基氮的測定采用康威微量擴散法[6]。

1.3.6 食鹽含量的測定

食鹽含量的測定參照GB/T 12457-2008《食品中氯化鈉的測定》。

1.3.7 非酶褐變指數(shù)的測定

非酶褐變指數(shù)采用Hendel法[7]，取5 mL樣液用50 mL 50%的乙醇提取1 h，其間不斷攪拌。提取液經(jīng)過濾紙 (雙圈牌，102型) 過濾。濾液用分光光度計在420 nm處測定吸收值。

1.3.8 游離氨基酸成分分析

采用高效液相色譜法(波長254 nm，溫度38 ℃，流速1 mL/min)，魚露樣品中氨基酸的濃度通過標準氨基酸來計算。

1.3.9 蛋白酶活力的測定

采用SB/T 10317-1999的方法測定。

1.3.10 菌落總數(shù)的測定

具體操作參照GB 4789.2-2010《菌落總數(shù)的測定》。發(fā)酵到規(guī)定的取樣時間，在無菌條件下取出樣品，稀釋到不同的梯度進行接種，在35 ℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析

結果使用 (平均值±標準差)表示，所有實驗平行3次。采用Excel 2007和Origin 75進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 氨基酸態(tài)氮和可溶性總氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮和可溶性總氮的含量是評價蛋白質降解程度和魚露質量的一個重要指標，也是魚露分級的重要依據(jù)[8]。

圖1 魚露中氨基酸態(tài)氮和可溶性總氮含量的變化

由圖1可知AA-N和TSN在發(fā)酵過程中的變化，AA-N含量的變化趨勢與TSN含量的變化相似。AA-N的含量在發(fā)酵前15天隨著發(fā)酵進行而不斷增加，在發(fā)酵15天時達到了1.337 g/dL，隨后又逐漸下降；TSN的含量在前10天隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，在發(fā)酵10天時達到了2.016 g/dL，隨后又逐漸下降；賦香發(fā)酵7天后，二者都進一步有所減少。隨著發(fā)酵的進行，蛋白酶的活力也會逐漸下降，所以二者的含量不會一直保持增加的趨勢；二者下降的原因可能是部分氨基酸與醛、酮類物質發(fā)生了美拉德反應而被消耗了，因為隨著發(fā)酵時間的延長非酶褐變指數(shù)在不斷增加；另一方面可能是部分氨基酸在一些腐敗微生物的作用下生成了揮發(fā)性鹽基氮和生物胺等物質。發(fā)酵完全結束后魚露中的AA-N和TSN含量分別為1.289，1.747 g/dL，都超過了國家一級魚露的標準[9]。

2.2 pH和總酸含量的變化

魚露在發(fā)酵過程中酸度和pH的變化也是反映其發(fā)酵程度的一個重要指標，有機酸對魚露的呈味起著重要作用[10]。

圖2 魚露中pH和總酸含量的變化

由圖2可知pH和總酸在發(fā)酵過程中的變化，pH和總酸含量的變化基本上呈相反的趨勢。在發(fā)酵前15天，魚露中的pH顯著下降，隨后基本保持不變，發(fā)酵結束后魚露中的pH為5.01；在發(fā)酵前15天，魚露中的總酸含量顯著上升，隨后逐漸下降，發(fā)酵結束后總酸含量為1.70 g/dL。

pH和總酸含量的變化主要是因為發(fā)酵過程中在一些微生物，如耐鹽乳酸菌等的作用下產(chǎn)生的有機酸類物質以及蛋白質被發(fā)酵分解成堿性的揮發(fā)性鹽基氮類物質以及氨基酸等共同作用的結果。在發(fā)酵前15天，魚露中的耐鹽乳酸菌是優(yōu)勢菌，它的快速生長使pH顯著下降，總酸含量升高，隨后腐敗菌生長較旺盛，產(chǎn)生了生物胺和揮發(fā)性鹽基氮等堿性物質，使pH的下降趨于緩慢，總酸含量下降；同時一些揮發(fā)性酸類物質在發(fā)酵過程中的揮發(fā)也會使總酸含量下降。

2.3 揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

TVB-N是衡量魚露腐敗程度的一個重要指標[11]。

圖3 魚露中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

由圖3可知TVB-N的變化，在發(fā)酵前10天，TVB-N隨發(fā)酵時間的延長顯著上升，隨后緩慢下降，賦香發(fā)酵7天后顯著下降，低于發(fā)酵初的含量。TVB-N的變化主要是因為在發(fā)酵初期發(fā)酵液中的一些腐敗菌未被抑制住，同時醬油曲帶過來的一些細菌發(fā)酵分解蛋白質也會使TVB-N的含量升高；隨著發(fā)酵時間的延長、耐鹽菌的增加以及發(fā)酵過程中揮發(fā)掉一部分使其有所減少；添加耐鹽醬油酵母后，酵母菌成為優(yōu)勢菌，使雜菌被抑制住，揮發(fā)性鹽基氮顯著降低。

2.4 NaCl含量的變化

本研究的目的是生產(chǎn)一種低鹽魚露，高濃度的食鹽會掩蓋魚露的風味，且不利于發(fā)酵。食鹽含量的變化見圖4。

圖4 魚露中食鹽含量的變化

在整個發(fā)酵過程中，食鹽的含量略有上升，整體上變化不大，添加耐鹽酵母進行賦香發(fā)酵后食鹽的含量顯著下降，可能是添加酵母發(fā)酵液后使魚露體積增加導致的。

2.5 非酶褐變指數(shù)的變化

非酶褐變指數(shù)也稱為美拉德褐變指數(shù)，是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸與醛、酮類等物質發(fā)生羰氨反應形成的。非酶褐變指數(shù)的變化見圖5。

圖5 魚露中非酶褐變指數(shù)的變化

在整個發(fā)酵過程中，非酶褐變指數(shù)不斷上升，賦香發(fā)酵結束后達到了1.14。由此說明魚露的色澤是在發(fā)酵過程中不斷形成的。

2.6 蛋白酶活力的變化

發(fā)酵液中含有多種蛋白酶，包括添加的風味蛋白酶、醬油曲分泌的蛋白酶以及一些微生物在繁殖過程中產(chǎn)生的蛋白酶，所以測定的蛋白酶活力為混合蛋白酶的活力?；旌系鞍酌傅幕盍ψ兓妶D6。

圖6 魚露中蛋白酶活力的變化

在發(fā)酵前5天，蛋白酶的活力略有上升，從第5天到第10天蛋白酶活力顯著下降，從第10天到第15天左右又顯著上升，隨后又逐漸下降。蛋白酶活力的變化主要是由食鹽濃度、微生物產(chǎn)酶等多種因素影響的。起初食鹽的濃度逐漸上升，醬油曲中的米曲霉還沒有完全適應生長，所以會使蛋白酶的活力降低；隨后醬油曲中的米曲霉快速繁殖，分泌蛋白酶，使蛋白酶的活力上升；發(fā)酵后期蛋白酶的活力又逐漸下降，主要是因為隨著發(fā)酵的進行及底物濃度的降低，發(fā)酵液中pH的變化、總酸的變化以及多種代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生使蛋白酶的活力降低。

2.7 菌落總數(shù)的變化

菌落總數(shù)是魚露的重要生物指標之一，也是判別食品衛(wèi)生質量的一項重要依據(jù)[12]。魚露發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化見圖7。

圖7 魚露中活菌數(shù)的變化

在發(fā)酵開始的前5天活菌數(shù)有所下降，在第5天到第10天活菌數(shù)略有上升，隨后活菌數(shù)逐漸減少，添加耐鹽酵母進行賦香發(fā)酵后，魚露中的活菌數(shù)顯著上升。在發(fā)酵初期由于食鹽的添加使非耐鹽菌的數(shù)量減少，隨后一些耐鹽的乳酸菌等成為優(yōu)勢菌，開始繁殖，醬油曲中的微生物適應條件也開始繁殖，使活菌數(shù)略有上升；隨著發(fā)酵的進行，大量代謝產(chǎn)物積累，營養(yǎng)素消耗，pH降低等都不利于細菌的生長，所以活菌數(shù)逐漸下降；發(fā)酵后期添加了耐鹽醬油酵母發(fā)酵液使活菌數(shù)增加。

2.8 游離氨基酸含量的變化

魚露中氨基酸的含量和組成影響魚露的風味和營養(yǎng)[13]。魚露中60%～80%的氨基化合物為氨基酸，其中谷氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和擷氨酸等被認為是魚露鮮味的有效成分[14]。魚露在發(fā)酵過程中氨基酸含量和組成見表1。

表1 低鹽魚露發(fā)酵過程中游離氨基酸組成與含量變化

由表1可知，亮氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、 纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸是魚露發(fā)酵過程中的主要氨基酸。隨著發(fā)酵過程的進行，各種游離氨基酸的含量先不斷增加，隨后略有下降，添加耐鹽醬油酵母進行賦香發(fā)酵后，顯著下降；氨基酸的總含量也發(fā)生了相似的變化。氨基酸含量的變化趨勢同發(fā)酵過程中AA-N和TSN含量的變化。主要是因為在發(fā)酵初期發(fā)酵液中的蛋白質被不斷水解成氨基酸，使其含量不斷增加；隨著發(fā)酵的進行部分氨基酸轉化成揮發(fā)性鹽基氮和生物胺等物質，且美拉德反應的繼續(xù)進行也在不斷消耗氨基酸，這些反應的共同作用使氨基酸含量發(fā)生了變化；添加耐鹽醬油酵母發(fā)酵液后可能使魚露的體積增大，氨基酸的濃度被稀釋而導致其含量顯著降低。

3 結論

發(fā)酵過程中AA-N，TSN，總酸和TVB-N的含量先上升后逐漸下降，賦香發(fā)酵后顯著下降，發(fā)酵結束后分別達到了(1.289±0.01)，1.747，(1.760±0.03) g/dL和(174.35±2.52) mg/100 g。pH先顯著下降，隨后基本保持不變，發(fā)酵完成時為(5.01±0.01) g/dL。食鹽含量在發(fā)酵過程中略有上升，賦香發(fā)酵后顯著降低，發(fā)酵結束后為(13.354±0.09) g/dL?；罹鷶?shù)和混合蛋白酶的活力在發(fā)酵過程中變化較復雜；游離氨基酸含量在發(fā)酵過程中先增加，隨后又略有降低，賦香發(fā)酵后顯著降低。

[1]張雪花,陳有容,齊鳳蘭,等.魚露發(fā)酵技術的研究現(xiàn)狀[J].上海水產(chǎn)大學學報,2000,9(4):355-358.

[2]薛佳,曾名湧.魚露制品的研究進展[J].肉類研究,2009(11):89-93.

[3]吳朝朝.利用淡水魚加工副產(chǎn)物速釀低鹽魚露工藝和風味的研究[D].南昌:南昌大學,2015.

[4]Beddows C G, Ismail M, Steinkraus K H.The use of biomelain in the investigation of fermentation[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1979(11):379-388.

[5]高瑞昌，陸文婷，劉向東，等.4種嗜鹽古菌發(fā)酵的龍頭魚魚露特性比較[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(11)：52-58.

[6]Conway E J,Byrne A.An absorption apparatus for the micro-determination of certain volatile substances:the micro-determination of ammonia[J].The Biochemical Journal,1933,27(2):419-429.

[7]Hendel C E,Bailey G F,Tailor D H.Measurement of nonenzymatic browning of dehydrated vegetables during storing storage[J].Food Technology,1950(3):44-48.

[8]侯溫甫,黃澤元,汪秀文,等.淡水魚加工下腳料速釀低鹽魚露的工藝研究[J].食品科學,2009,30(23):322-325.

[9]肖宏艷,曾慶孝.潮汕魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味成分分析[J].中國調味品,2010,35(2):92-96.

[10]崔春.海產(chǎn)低值魚深度酶解工藝與機理研究[D].廣州:華南理工大學,2005.

[11]晁岱秀,朱志偉,曾慶孝.低鹽外加曲發(fā)酵潮汕魚露的理化性質變化[J].食品與生物技術學報,2010,29(3):410-415.

[12]陶忠,陳書霖,翁武銀.低鹽魚露在保存中的性質變化[J].中國調味品,2013,38(1):24-27.

[13]Lopetcharat K,Choi Y J,Park J W,et al.Fish sauce products and manufacturing:a review[J].Food Reviews International,2001,17(1):65-88.

[14]Park J N,Fukumoto Y,Fujita E.Chemical composition of fish sauces produced in Southeast and East Asian countries[J].Journal of Food Composition and Analysis,2001(14):113-125.

Study on the Biochemical Characteristics of Low-salt Fish Sauce with By-products of Freshwater Fish

ZHOU Min, YUAN Mei-lan, CHEN Li-li, ZHAO Li*, WU Zhao-zhao, JING Da-li

(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Branch of Research and Development on Freshwater Fish Processing Technology, Nanchang 330013, China)

Take freshwater by-products as the raw materials to produce fish sauce by adopting the methods of adding salt piecewise and adding salt-tolerant soy sauce yeast at the late stage. The biochemical characteristics are researched during the fermentation process. The results show that the content of AA-N, TSN, total acids and TVB-N increases firstly during the initial fermentation time and then slightly decreases thereafter and decreases significantly after flavor fermentation respectively. The pH value decreases significantly firstly and generally remains stable. The salt content increases slightly during the fermentation. The change of viable count and mixed protease activity is complex during the fermentation. The content of free amino acid increases firstly during flavor initial fermentation time and then slightly decreases thereafter.

freshwater by-products; low-salt fish sauce; fermentation; biochemical characteristics

2016-07-15 *通訊作者

南昌市農(nóng)業(yè)科技支撐計劃項目(洪財企[2012]80號)；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助項目；江西省科技廳科技支撐重大項目(20152ACF60008)

周敏(1991-)，女，河南安陽人，碩士，研究方向：食品化學； 趙利(1967-)，女，江西南昌人，教授，博士，研究方向：食品化學。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.005

1000-9973(2017)01-0018-05