響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化兩步酶法合成母乳脂替代品工藝及脂肪酸組成分析

熊志琴，潘麗軍*，姜紹通，沈 鴻，操麗麗

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化兩步酶法合成母乳脂替代品工藝及脂肪酸組成分析

熊志琴，潘麗軍*，姜紹通，沈 鴻，操麗麗

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

采用兩步酶法合成母乳脂替代品。以油茶籽油和棕櫚酸為原料，在有機(jī)相體系中利用脂肪酶Novozym 435催化合成Sn-2位富含棕櫚酸的甘油三酯，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)，獲得了最佳合成條件為反應(yīng)溶劑正己烷、溶劑用量10 mL/g、底物（棕櫚酸-油茶籽油）質(zhì)量比1.1∶1、脂肪酶用量（以底物質(zhì)量計(jì)）10.1%、反應(yīng)時(shí)間16.5 h、反應(yīng)溫度50 ℃，Sn-2位棕櫚酸含量達(dá)到66.08%；以第一步酸解反應(yīng)得到的甘油三酯和魚油為底物，經(jīng)Sn-1,3專一性脂肪酶Lipozyme TL IM催化酯交換制備母乳脂替代品。制品檢測(cè)結(jié)果表明，其不僅棕櫚酸的含量和分布與母乳脂相似，而且具有較高含量的二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等多不飽和脂肪酸，亦可作為嬰兒配方奶粉的脂肪來(lái)源。

母乳脂替代品；油茶籽油；脂肪酶；魚油；多不飽和脂肪酸

母乳是天然的生物膠體體系，含有脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)和其他生理活性物質(zhì)，是新生嬰兒首選食品[1-2]。母乳脂中98%為甘油三酯（tiacylglycerols，TAGs），主要脂肪酸有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid，EPA）等[3-4]，其中70%左右棕櫚酸位于甘油骨架Sn-2位上，而油酸和亞油酸等不飽和酸則優(yōu)先分布在Sn-1,3位上[5]。大量研究表明[6-7]，棕櫚酸只有富集在甘油酯Sn-2位上才有助于提高嬰兒對(duì)脂肪和鈣質(zhì)的吸收率，降低便秘、腸阻的可能性。近年來(lái)由于受工作壓力、個(gè)人因素等影響，常常出現(xiàn)母乳不足、母乳營(yíng)養(yǎng)缺乏等情況，配方奶粉便成為供給嬰兒健康成長(zhǎng)與發(fā)育的理想輔助食品[8]。然而，配方奶粉中的油脂大多由天然植物油直接調(diào)配而成，不僅Sn-2位棕櫚酸含量與母乳脂相差較大[9]，而且缺少促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育的EPA、DHA、ARA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。因此，開發(fā)一種脂肪酸組成和分布與母乳脂相似的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是改善嬰兒營(yíng)養(yǎng)與健康的必然趨勢(shì)。

母乳脂作為母乳的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，既提供給嬰兒所需50%左右的能量，又能促進(jìn)嬰兒體內(nèi)必需脂肪酸和脂溶性維生素的消化吸收[10]。目前，Zou Xiaoqiang等[11]采用豬油（Sn-2位富含棕櫚酸）和預(yù)先調(diào)配好的混合植物油經(jīng)Sn-1,3專一性脂肪酶催化合成母乳脂替代品；Nielsen等[12]以豬油和大豆油脂肪酸為原料制備出母乳脂替代品，但是由于宗教信仰、風(fēng)俗習(xí)慣等因素，一些國(guó)家排斥使用豬油，因此其市場(chǎng)潛力遠(yuǎn)小于植物油。用植物油制備母乳脂替代品的研究主要有：Esteban等[13]以富含棕櫚酸的棕櫚硬脂和油酸為底物合成1,3-二油酸-2-棕櫚酸型母乳脂替代品；Turan等[14]將棕櫚酸富集在富含VE的榛子油Sn-2位上，制備出具有一定氧化穩(wěn)定性的母乳脂替代品；Teichert等[15]將三棕櫚酸甘油酯和富含十八碳四烯酸（stearidonic acid，SDA）的大豆油進(jìn)行酶促酯交換，從而合成含有SDA的母乳脂替代品。

油茶籽油富含β-谷甾醇、生育酚等生理活性物質(zhì)，不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%左右[16]，且Sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量較一般植物油高。魚油富含EPA、DHA、ARA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，具有增強(qiáng)記憶、促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育和改善神經(jīng)傳導(dǎo)等功能[17]，是目前嬰兒配方奶粉首選的補(bǔ)充劑，但魚油的脂肪酸含量和分布與母乳脂相差較大，需對(duì)其進(jìn)行改性與修飾。然而目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)油茶籽油和魚油改性制備母乳脂替代品的研究報(bào)道尚較少。本研究以油茶籽油為原料，棕櫚酸為?；w，在有機(jī)相體系中利用脂肪酶Novozym 435催化合成Sn-2位富含棕櫚酸的甘油三酯，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)探究最佳合成條件；采用酸解反應(yīng)得到的甘油三酯和魚油為底物，經(jīng)Sn-1,3專一性脂肪酶Lipozyme TL IM催化酯交換制備出一種母乳脂替代品；對(duì)其主要脂肪酸組成進(jìn)行檢測(cè)與分析，為母乳脂替代品的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽油、魚油 市售；Novozym 435酶、Lipozyme TL IM酶 美國(guó)諾維信公司；豬胰脂肪酶、膽酸鈉 北京索萊寶科技有限公司；棕櫚酸、氫氧化鉀、氯化鈣、鹽酸、正己烷、無(wú)水乙醇、甲醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷（色譜純）天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硅膠板 安徽良臣硅源材料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SKY-110WX型恒溫水浴搖床 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heizbad公司；GC7890A氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜儀 日本島津制作所；AR1140/C型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Sn-2位富含棕櫚酸甘油三酯的合成

稱取1.0 g油茶籽油和適量棕櫚酸于25 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的反應(yīng)溶劑和脂肪酶Novozym 435，塞緊瓶塞，密封，于轉(zhuǎn)速165 r/min的恒溫水浴搖床中反應(yīng)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)方法，分別考察反應(yīng)溶劑種類（正己烷、環(huán)己烷、叔丁醇、丙酮、叔戊醇）、溶劑用量（4、6、8、10、12、14 mL/g）、反應(yīng)時(shí)間（4、8、12、16、20、24 h）、底物（棕櫚酸-油茶籽油）質(zhì)量比（0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1）、反應(yīng)溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）、脂肪酶用量（按底物質(zhì)量計(jì)）（4%、6%、8%、10%、12%、14%）因素對(duì)甘油三酯棕櫚酸含量與分布的影響，試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)、顯著性分析，結(jié)果用±s表示。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，選取影響較顯著的因素及其較好的水平區(qū)間進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定酸解反應(yīng)最優(yōu)合成條件，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用±s表示。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平選擇如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Factors and their levels used in the response surface design

1.3.4 有機(jī)溶劑結(jié)晶法提純甘油三酯

1.3.4.1 甘油三酯的分離純化

根據(jù)孫登文等[18]的方法并作適當(dāng)修改。將反應(yīng)液經(jīng)過(guò)濾除酶、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑后，加入適量無(wú)水乙醇，在57～60 ℃條件下攪拌進(jìn)行溶解，然后在25～30 ℃條件下邊冷卻邊攪拌至目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)晶析出，抽濾后再加入適量的體積比為2∶2∶1的混合溶劑（甲醇-乙醇-水）進(jìn)行重結(jié)晶，真空干燥即得純品。

1.3.4.2 甘油三酯純度的測(cè)定

參考?jí)奂逊芠19]的氣相色譜-質(zhì)譜方法稍做修改。具體操作條件如下：

色譜柱：DB-17HT毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速1.5 mL/min；分流比20∶1，進(jìn)樣量1 μL；溶劑延遲2 min；進(jìn)樣口溫度350 ℃，接口溫度340 ℃，柱溫100 ℃，升溫程序?yàn)椋阂?0 ℃/min升至 250 ℃，再以10 ℃/min升至340 ℃，保持20 min。離子源為電子電離源；離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV；電子倍增器電壓1.2 kV；質(zhì)量掃描范圍40～1 000 u。

按峰面積歸一法計(jì)算甘油三酯的純度，如式（1）所示：

式中：S1為單甘酯對(duì)應(yīng)的峰面積；S2為甘油二酯對(duì)應(yīng)的峰面積；S3為甘油三酯對(duì)應(yīng)的峰面積；S4為游離脂肪酸對(duì)應(yīng)的峰面積；S5為其他物質(zhì)對(duì)應(yīng)的峰面積。

1.3.4.3 甘油三酯回收率的計(jì)算

式中：m1為純化后的樣品質(zhì)量/g；p1為純化后的樣品純度/%；m0為純化前的樣品質(zhì)量/g；p0為純化前的樣品純度/%。

1.3.5 母乳脂替代品的制備

稱取酸解反應(yīng)得到的甘油三酯和魚油各1 g于25 mL具塞錐形瓶中，加入160 mg脂肪酶Lipozyme TL IM（按底物質(zhì)量計(jì)，8%）和8 mL正己烷（按底物質(zhì)量計(jì)，4 mL/g），通氮?dú)獗Ｗo(hù)防止氧化，于轉(zhuǎn)速165 r/min、溫度50 ℃恒溫水浴搖床反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)通氮?dú)饫鋮s至室溫。

1.3.6 脂肪酸組成測(cè)定

1.3.6.1 總脂肪酸組成測(cè)定

參照潘麗軍等[20]的方法略作修改，將分離純化后的產(chǎn)物經(jīng)薄層層析分離后，刮下甘油三酯條帶溶于3 mL的色譜純正己烷中，加入500 μL KOH-甲醇溶液（1 mol/L），劇烈搖晃1 min后，加入3 mL蒸餾水靜置分層，取上清液用無(wú)水硫酸鈉干燥后進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.6.2 Sn-2位脂肪酸組成測(cè)定

采用Nagachinta等[21]的方法進(jìn)行檢測(cè)。取一定量的油脂，用胰脂酶將其水解成2-單甘酯，經(jīng)薄層層析分離后，刮下單甘酯條帶并溶于正己烷中，按照1.3.6.1節(jié)方法進(jìn)行甲酯化，氣相色譜分析其脂肪酸組成。

1.3.6.3 脂肪酸甲酯的氣相色譜分析條件

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；檢測(cè)器：火焰離子化檢測(cè)儀；進(jìn)樣口溫度230 ℃；升溫程序：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持1 min后，以3 ℃/min升至230 ℃，保留12 min；氮?dú)饬魉?.8 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。

按峰面積歸一法計(jì)算油脂中不同脂肪酸的含量，如式（3）所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 反應(yīng)溶劑（A）、溶劑用量（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）、底物質(zhì)量比（D）、反應(yīng)溫度（E）、脂肪酶用量（F）對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響Fig. 1 Effects of solvent type and dosage (B), reaction time (C), palmitic acid/camellia seed oil ratio (D), reaction temperature (E), enzyme dosage (F) on the content and distribution of palmitic acid

由圖1A可知，以極性較小的正己烷、環(huán)己烷為反應(yīng)溶劑時(shí)，合成的甘油三酯總棕櫚酸、Sn-2位棕櫚酸含量均相近，且高于極性較大的叔丁醇、丙酮和叔戊醇，考慮到較低沸點(diǎn)的正己烷在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)相對(duì)容易去除，故選擇正己烷為反應(yīng)溶劑。圖1B顯示，較適宜的溶劑用量為10 mL/g。在圖1C中，總棕櫚酸與Sn-2位棕櫚酸含量在0～16 h內(nèi)迅速增長(zhǎng)（P＜0.05），而在16～24 h過(guò)程中兩者均增長(zhǎng)緩慢并趨于平衡，考慮到較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間會(huì)造成部分脂肪酶失活，多種副產(chǎn)物產(chǎn)生[22-23]，故選擇反應(yīng)時(shí)間16 h。圖1D表明，底物質(zhì)量比在1∶1～1.5∶1范圍內(nèi)時(shí)，總棕櫚酸與Sn-2位棕櫚酸含量趨于平衡，且分別達(dá)到最高，繼續(xù)增加質(zhì)量比，總棕櫚酸含量變化差異不顯著（P＞0.05），Sn-2位棕櫚酸含量顯著下降（P＜0.05），原因可能是過(guò)量的棕櫚酸奪走了脂肪酶表面必需水，包裹脂肪酶，增加空間位阻，進(jìn)而影響脂肪酶催化效率[24]，為了降低生產(chǎn)成本，選擇較適底物質(zhì)量比1∶1。由圖1E可知，反應(yīng)溫度50 ℃時(shí)，兩指標(biāo)值均達(dá)到最高，溫度繼續(xù)升高呈下降趨勢(shì)，故反應(yīng)溫度50 ℃是較適宜的。在圖1F中，當(dāng)脂肪酶用量在4%～10%范圍內(nèi)時(shí)，兩指標(biāo)值呈顯著增加（P＜0.05），繼續(xù)增加酶量，兩者皆處于平緩波動(dòng)狀態(tài)，變化差異不顯著（P＞0.05）。綜合考慮選擇較適脂肪酶用量為10%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 回歸模型的有效性分析與方差分析

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance of the fitted quadratic regression equation

由表3可知，二次回歸模型的P＜0.000 1，說(shuō)明此回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.272 3＞0.05，說(shuō)明該模型可以接受；決定系數(shù)R2為0.968 7，說(shuō)明回歸方程能較好地反映響應(yīng)值與各因素之間變化關(guān)系[25]；校正決定系數(shù)R2Adj為0.937 4，表明此回歸模型可以解釋93.74%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性。A、B、C、D、AC、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01）。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6獲得的回歸方程模型為：Y/%=63.13＋5.40A＋3.77B＋6.03C＋2.23D－1.98AB－3.43AC＋3.83AD－6.03BC－3.56BD－4.00A2－6.16B2－5.48C2－8.82D2。根據(jù)此回歸方程，確定合成Sn-2位富含棕櫚酸甘油三酯的最優(yōu)工藝條件為：反應(yīng)溫度50.40 ℃、底物質(zhì)量比1.08∶1、脂肪酶用量10.08%、反應(yīng)時(shí)間16.42 h。此條件下，合成的甘油三酯Sn-2位上棕櫚酸含量達(dá)到65.79%。

圖2 各因素交互作用對(duì)Sn-2棕櫚酸含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig. 2 Response surface and contour plots showing the effects of four variables on the content of palmitic acid at Sn-2 position

響應(yīng)面設(shè)計(jì)中，兩因素交互作用響應(yīng)面和等高線如圖2所示?？梢钥闯觯珹C、AD、BC、BD的交互作用對(duì)甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量影響的主次順序?yàn)椋築C＞AD＞BD＞AC。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法獲得的最佳合成條件，進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，圓整后最終確定的條件為反應(yīng)溫度50 ℃、底物質(zhì)量比1.1∶1、脂肪酶用量10.1%、反應(yīng)時(shí)間16.5 h，此條件下甘油三酯Sn-2上棕櫚酸含量平均值為66.08%。該值落在響應(yīng)值Y的95%預(yù)測(cè)區(qū)間[62.50%，69.08%]，所建回歸模型具有較好的擬合性。

2.3 有機(jī)溶劑結(jié)晶法提純甘油三酯

表4 Sn-2位富含棕櫚酸甘油三酯及母乳脂替代品的純度和回收率Table4 Purity and recovery of TAGs rich in PA at Sn-2 position and human milk fat substitutes %

由表4可知，經(jīng)有機(jī)溶劑重結(jié)晶后，兩步酶法合成的母乳脂替代品純度達(dá)到94.98%，總回收率（結(jié)晶回收率×重結(jié)晶回收率）為92.24%。

2.4 產(chǎn)物主要脂肪酸組成檢測(cè)與分析

采用1.3.6.3節(jié)條件，分別對(duì)油茶籽油、魚油、反應(yīng)產(chǎn)物Sn-2位富含棕櫚酸甘油三酯和母乳脂替代品進(jìn)行主要脂肪酸含量檢測(cè)，結(jié)果見表5～7。

表5 總脂肪酸的含量Table5 Total fatty acid contents of camellia seed oil, fish oil, TAGs rich in PA at Sn-2 position and human milk fat substitutes %

表6 Sn-2位脂肪酸的含量Table6 Sn-2 fatty acid contents of camellia seed oil, fish oil, TAGs rich in PA at Sn-2 position and human milk fat substitutes %

表7 Sn-2位脂肪酸的相對(duì)含量Table7 The relative contents of Sn-2 fatty acids in camellia seed oil, fish oil, TAGs rich in PA at Sn-2 position and human milk fat substitutes %

由表5～7可知，兩步酶法合成的母乳脂替代品，Sn-2位棕櫚酸的相對(duì)含量達(dá)到66.92%，與母乳脂[26]極相似，明顯高于蔣與燕[27]和Yüksel[28]等直接采用棕櫚硬脂為原料合成的母乳脂替代品（Sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量分別為50.61%和46.20%）；多不飽和脂肪酸EPA、DHA、ARA總含量分別為14.50%、7.38%、0.99%；硬脂酸、油酸、亞油酸等脂肪酸的含量與分布基本處在母乳脂標(biāo)準(zhǔn)范圍[26]之內(nèi)。

3 結(jié) 論

以甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量為指標(biāo)，確定酸解反應(yīng)的最佳反應(yīng)溶劑為正己烷，較適宜溶劑用量為10 mL/g；利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)獲得最優(yōu)工藝條件為反應(yīng)溫度50 ℃、底物質(zhì)量比1.1∶1、脂肪酶用量10.1%（以底物質(zhì)量計(jì)）、反應(yīng)時(shí)間16.5 h，此條件下，測(cè)得甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量為66.08%。

兩步酶法合成的母乳脂替代品，經(jīng)有機(jī)溶劑重結(jié)晶分離提純后，純度達(dá)到94.98%，總回收率為92.24%；主要脂肪酸含量和分布基本處于母乳脂標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，總棕櫚酸與Sn-2位棕櫚酸含量分別達(dá)到27.88%、55.97%，棕櫚酸分布在Sn-2位的相對(duì)含量為66.92%，與母乳脂極相似。

制品中具有較高含量的不飽和脂肪酸，單不飽和脂肪酸總含量為38.55%，以油酸、棕櫚油酸、花生烯酸為主；多不飽和脂肪酸總含量為27.43%，以EPA、DHA和亞油酸為主，其中EPA、DHA含量分別為14.50%、7.38%，表明該母乳脂替代品是一種營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較高的油脂，能夠增強(qiáng)嬰兒記憶力、促進(jìn)嬰兒智力發(fā)育。

[1] ZOU X Q, HUANG J H, JIN Q Z, et al. Model for human milk fat substitute evaluation based on triacylglycerol composition prof le[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(1): 167-175. DOI:10.1021/jf304094p.

[2] 杜芳芳, 李建平, 鄭曉輝, 等. 母乳及嬰幼兒配方奶粉中脂肪酸的組成及分布特點(diǎn)[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(11): 245-250. DOI:10.7506/ spkxl002-663m201511046.

[3] PINA-RODRIGUEZ A M, AKOH C C. Synthesis and characterization of a structured lipid from amaranth oil as a partial fat substitute in mil k-based infant formula[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(15): 6748-6756. DOI:10.1021/jf901048x.

[4] MENESES F, TORRES A G, TRUGO N M. Essential and long-chain polyunsaturated fatty acid status and fatty acid composition of breast milk of lactating adolescents[J]. British Journal of Nutrition, 2008, 100(5): 1029-1037. DOI:10.1017/S0007114508945177.

[5] ZOU L, AKOH C C. Characterisation and optimisation of physical and oxidative stability of structured lipid-based infant formula emulsion: effects of emulsif ers and biopolymer thickeners[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 2486-2494. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.05.029.

[6] SONG Q, LIU Y D, LI X M, et al. Effect of positional distribution of palmitic acid in triglycerides on the absorption of the nutrition in rats[J]. Science and Technology of Food Industry, 2012, 33(16): 349-354. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.16.010.

[7] INNIS S M, DYER R, NELSON C M. Evidence that palmitic acid is absorbed as Sn-2 monoacylglycerol from human milk by breast-fed infants[J]. Lipids, 1994, 29(8): 541-545. DOI:10.1007/BF02536625.

[8] 鐘金鋒, 覃小麗, 王永華. 人乳脂替代品的酶法合成及其評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(16): 377-384. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2014.16.074.

[9] LóPEZ-LóPEZ A, LóPEZ-SABATER M C, CAMPOY-FOLGOSO C, et al. Fatty acid and Sn-2 fatty acid composition in human milk from Granada (Spain) and in infant formulas[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2002, 56(12): 1242-1254. DOI:10.1038/ sj.ejcn.1601470.

[10] WANG Y H, MAI Q Y, QIN X L, et al. Establishment of an evaluation model for human milk fat substitutes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(1): 642-649. DOI:10.1021/jf903048p.

[11] ZOU X Q, HUANG J H, JIN Q Z, et al. Preparation of human milk fat substitutes from lard by lipase-catalyzed interesterif cation based on triacylglycerol profiles[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 2014, 91(12): 1987-1998. DOI:10.1007/s11746-014-2533-z.

[12] NIELSEN N S, YANG T K, XU X B, et al. Production and oxidative stability o f a human milk fat substitute produced from lard by enzyme technology in a pilot packed-bed reactor[J]. Food Chemistry, 2006, 94(1): 53-60. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.10.049.

[13] ESTEBAN L, JIMéNEZ M J, HITA E, et al. Production of structured triacylglycerols rich in palmitic acid at Sn-2 position and oleic acid at sn-1,3 positions as human milk fat substitutes by enzymatic acidolysis[J]. Biochemical Engineering Journal, 2011, 54(1): 62-69. DOI:10.1016/j.bej.2011.01. 009.

[14] TURAN D, YE?IL?UBUK N ?, AKOH C C. Enrichment of Sn-2 position of hazelnut oil with palmitic acid: optimization by response surface methodology[J]. LWT-Food Science and Technology, 2013, 50(2): 766-772. DOI:10.1016/j.lwt.2012.07.009.

[15] TEICHERT S A. Stearidonic acid soybean oil enriched with palmitic acid at the Sn-2 position by enzymatic interesterification for use as human milk fat analogues[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(10): 5692-5701. DOI:10.1021/jf200336t.

[16] XIE J, LIU T S, YU Y X, et al. Rapid detection a nd quantif cation by GC-MS of camellia seed oil adulterated with soybean oil[J]. Journal of Oil and Fat Industries, 2013, 90(5): 641-646. DOI:10.1007/s11746-013-2209-0.

[17] CAO S L, GUAN Z F, CAI Y P, et al. The analysis and research of comp onents of fatty acid in deep-sea f sh oil and seal oil[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 1999, 20(1): 70-75.

[18] 孫登文, 湛日景. 用溶劑結(jié)晶法分離單脂肪酸甘油酯的工藝: 92100594.6[P]. (1993-08-04).

[19] 壽佳菲. 中長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油三酯的酶法制備與分離純化研究[D]. 合肥: 合肥工業(yè)大學(xué), 2012: 22-24.

[20] 潘麗軍, 壽佳菲, 符克皇, 等. MLM型結(jié)構(gòu)脂的酶法合成及其理化性質(zhì)分析[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(12): 18-23.

[21] NAGACHINTA S, AKOH C C. Production and characterization of DHA and GLA-enriched structured lipid from palm olein for infant formula use[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 2013, 90(8): 1141-1149. DOI:10.1007/s11746-013-2255-7.

[22] DENG L, XU X B, HARALDSSON G G, et al. Enzymatic production of alkyl esters through alcoholysis: a critical evaluation of lipases and alcohols[J]. Journal of Oil and Fat Industries, 2005, 82(5): 341-347. DOI:10.1007/s11746-005-1076-3.

[23] HITA E, ROBLES A, CAMACHO B, et al. Production of structured triacylglycerols (STAG) rich in docosahexaenoic acid (DHA) in position 2 by acidolysis of tuna oil catalyzed by lipases[J]. Process Biochemistry, 2007, 42(3): 415-422. DOI:10.1016/ j.procbio.2006.09.023.

[24] MU?íO M D M, ROBLES A, ESTEBAN L, et al. Synthesis of structured lipids by two enzymatic steps: ethanolysis of f sh oils and esterif cation of 2-monoacylglycerols[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(7): 723-730. DOI:10.1016/j.procbio.2009.03.002.

[25] 曹劉霞. 非水相酶催化合成L-抗壞血酸油酸酯、結(jié)構(gòu)表征及性質(zhì)研究[D]. 鄭州: 河南工業(yè)大學(xué), 2011: 25-29.

[26] QIN X L, YANG B, WANG Y H. Study on composition of fa tty acid and distribution of Sn-2 fatty acid in colostrum human milk[J]. Science and Technology of Food Industry, 2010, 31(5): 81-83. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2010.05.070.

[27] 蔣與燕. 酶法催化生產(chǎn)母乳脂肪替代物的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2013: 26-41.

[28] Y?KSEL A, YE?IL?UBUK N ?. Enzymatic production of human milk fat analogues containing stearidonic acid and optimization of reactions by response surface methodology[J]. LWT-Food Science and Technology, 2012, 46(1): 210-216. DOI:10.1016/j.lwt.2011.10.004.

Optimization of Two-Step Lipase-Catalyzed Synthesis of Human Milk Fat Substitutes by Response Surface Methodology and Fatty Acid Composition Analysis

XIONG Zhiqin, PAN Lijun*, JIANG Shaotong, SHEN Hong, CAO Lili
(Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province, School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Human milk fat substitutes (HMFS) were prepared by a two-step enzymatic procedure. Firstly, triacylglycerols (TAGs) rich in palmitic acid (PA) at Sn-2 position were synthesized by Novozym 435 lipase-catalyzed acidolysis of camellia seed oil with palmitic acid in organic system. The optimal alcoholysis conditions were determined using one-factor-ata-time experiments and response surface methodology as follows: n-hexane as reaction solvent at a dosage of 10 mL/g; palmitic acid/camellia seed oil mass ratio, 1.1:1; lipase dosage (on the basis of substrate mass), 10.1%; reaction time, 16.5 h; and temperature, 50 ℃. Under these conditions, TAGs with 66.08% PA at Sn-2 position were obtained. Then HMFS were synthesized by transesterif cation of these TAGs with f sh oil catalyzed by the Sn-1,3 specif c lipase Lipozyme TL IM. The f nal product was tested, and the results showed that the content and distribution of palmitic acid in the HMFS were similar to those of human milk fat. Besides, it had high levels of eicosapentaenoic acid (EPA), and docosahexenoic acid (DHA). Therefore, the HMFS could be used as a fat source for infant formula.

human milk fat substitutes; camellia seed oil; lipase; f sh oil; polyunsaturated fatty acids

10.7506/spkx1002-6630-201702039

TQ645

A

1002-6630（2017）02-0248-07

熊志琴, 潘麗軍, 姜紹通, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化兩步酶法合成母乳脂替代品工藝及脂肪酸組成分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 248-254. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702039. http://www.spkx.net.cn

XIONG Zhiqin, PAN Lijun, JIANG Shaotong, et al. Optimization of two-step lipase-catalyzed synthesis of human milk fat substitutes by response surface methodology and fatty acid composition analysis[J]. Food Science, 2017, 38(2): 248-254. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702039. http://www.spkx.net.cn

2016-06-28

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD02B04）

熊志琴（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚Y源綜合利用。E-mail：xiongzhiqin929@163.com

*通信作者：潘麗軍（1955—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用。E-mail：pljhfut@tom.com