龔 競， 田 莎， 侯 勇， 趙歡歡， 朱 勇

(西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716)

HCl和DMSO阻斷滯育條件下桑蠶卵殼電鏡觀察

龔 競， 田 莎， 侯 勇， 趙歡歡， 朱 勇

(西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716)

【目的】探討桑蠶Bombyxmori滯育阻斷機理，比較HCl、二甲基亞砜(DMSO)法阻斷蠶卵滯育后卵殼表面發(fā)生的一系列變化?！痉椒ā坑肏Cl和DMSO分別在產(chǎn)后20和12 h 處理蠶卵，利用掃描電鏡觀察卵殼表面及氣孔在處理后不同時間點的變化。【結(jié)果】HCl和DMSO處理均能成功地阻斷蠶卵滯育的發(fā)生，蠶卵平均孵化率分別為93.37%和87.81%。掃描電鏡觀察HCl和DMSO處理的卵殼表面蝕刻效果明顯，均出現(xiàn)了“脂質(zhì)”脫落物；并且處理后蠶卵的氣孔有逐步增大的趨勢，與DMSO處理相比較，HCl處理獲得的現(xiàn)象更為明顯?！窘Y(jié)論】卵殼表面變化可能與桑蠶滯育的阻斷有關(guān)。

桑蠶; 阻斷滯育; HCl; DMSO; 掃描電鏡; 卵殼

昆蟲對不利環(huán)境的規(guī)避是其生存和廣泛繁殖的重要條件之一，滯育是其躲避不利條件增強適應(yīng)性的一種表現(xiàn)。不利條件規(guī)律性地出現(xiàn)，經(jīng)年累月會引起昆蟲體內(nèi)的周期性變化，這種變化逐漸成為昆蟲的遺傳特性[1]。因此，昆蟲會出現(xiàn)某一世代某一蟲態(tài)的發(fā)育停止；經(jīng)過一段時期或某一因子刺激后，才重新恢復(fù)發(fā)育[2]。昆蟲的這一特性，使之成為世界上數(shù)量龐大、種類眾多的生物群體。

桑蠶Bombyxmori是鱗翅目昆蟲的模式生物之一，是卵滯育昆蟲的典型代表[3-4]。在蠶業(yè)生產(chǎn)中，人們常在滯育卵產(chǎn)下后的適當(dāng)時期，通過一些物理、化學(xué)方法阻止蠶卵滯育，使蠶卵進入活化狀態(tài)，在適當(dāng)?shù)臏囟取穸群凸庹諚l件下催青，孵化出蟻蠶(1齡幼蟲)再飼育。用HCl處理的即時浸酸法阻斷滯育是目前最常用的方法[5]。Yamamoto等[6]研究表明，二甲基亞砜(DMSO)及部分烷類試劑也能不同程度地阻斷蠶卵進入滯育,但鮮見被處理后卵殼的變化觀察。雖然人們在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)了很多阻斷蠶卵進入滯育的方法，但是阻斷滯育的機理迄今仍未完全闡明。

為了探究HCl和DMSO等阻斷桑蠶蠶卵進入滯育的機理，本文利用掃描電子顯微鏡(SEM)對即時浸酸法和DMSO法處理后的蠶卵進行了觀察，重點關(guān)注了卵殼表面和氣孔變化，比較處理組與對照組的差異，為阻斷滯育機理的研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

供試桑蠶：二化性桑蠶品種大造，由西南大學(xué)桑蠶基因庫提供。催青溫度為25 ℃，戊3胚子前為自然光照，戊3胚子后為每天18 h長光照。收蟻后在25 ℃,光周期12 h光∶12 h暗條件下飼養(yǎng)幼蟲、上簇營繭、化蛹化蛾、交配，產(chǎn)下滯育卵。

1.2 方法

選用8個蛾圈做試驗，每個蛾圈分成3份：即時浸酸處理、DMSO處理、不做任何處理(對照)。按照常規(guī)方法催青，孵化后調(diào)查統(tǒng)計孵化率。

1.2.1 蠶卵處理 DMSO處理：蠶卵產(chǎn)下后12 h，室溫25 ℃，DMSO溶液浸泡45 min，浸畢后流水洗凈，晾干[6]；HCl處理：蠶卵產(chǎn)下后20 h，室溫25 ℃，1.100 g·mL-1的HCl溶液浸泡70 min，浸畢后流水洗凈，晾干[7]。

1.2.2 電鏡樣品制備及觀察 2種方法處理的蠶卵和未處理的滯育卵，在產(chǎn)后的12(20)、48、72 h，5、9 d分別取樣，每次取20粒蠶卵，先用1×PBS緩沖液清洗，洗去卵殼表面附著物。采用戊二醛和鋨酸雙固定：取洗凈的蠶卵置于w為2.5%的戊二醛溶液4 ℃固定2 h，然后用1×PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10 min；接著用w為1%的鋨酸溶液固定2 h后，用0.1 mol·L-1的PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10 min。經(jīng)過雙固定的樣品，用乙醇和叔丁醇進行梯度脫水。最后樣品在空氣中自然干燥。干燥好的樣品用導(dǎo)電膠粘貼在掃描電鏡的載物臺上，離子濺射儀鍍膜后用掃描電鏡(JCM-5000, NIKON)對蠶卵表面進行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將HCl、DMSO處理的蠶卵和未處理的滯育卵放入25 ℃、相對濕度75%的培養(yǎng)箱常規(guī)催青，統(tǒng)計蠶卵孵化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶卵的孵化率

HCl和DMSO處理10 d后蠶卵的孵化率調(diào)查結(jié)果見表1。8個蛾圈的蠶卵均正常孵化，統(tǒng)計項目中除蟻蠶的孵化率以外，還統(tǒng)計了轉(zhuǎn)青死卵數(shù)、未受精卵數(shù)等指標。其他卵所占比例參照孵化率的統(tǒng)計。從表1數(shù)據(jù)可以看出，HCl阻斷滯育是成功的，孵化卵所占比例很高，達93.37%。結(jié)果顯示DMSO阻斷滯育也是成功的，蠶卵平均孵化率為87.81%。對照組蠶卵產(chǎn)下后放入25 ℃的培養(yǎng)箱，40～48 h開始轉(zhuǎn)色，呈現(xiàn)淡赤豆色，之后顏色逐漸加深，變?yōu)槌喽股?、固有色?0 d后蠶卵幾乎不孵化，完全進入滯育，統(tǒng)計結(jié)果詳見表1。

將HCl和DMSO處理的平均孵化率和對照組蠶卵平均孵化率進行了對比，2種方法處理均能較好地阻斷滯育轉(zhuǎn)而活化蠶卵，孵化率均在87%以上，而對照的蠶卵絕大部分進入滯育。

表1 HCl和DMSO處理后蠶卵的孵化率
Tab.1 The hatching rates of silkworm eggs treated by HCl or DMSO

區(qū)號孵化卵數(shù)/粒死卵數(shù)/粒轉(zhuǎn)青死卵數(shù)/粒未受精卵數(shù)/粒孵化率/%HClDMSO對照HClDMSO對照HClDMSO對照HClDMSO對照1)HClDMSO對照1120152200009030097．5694．412．1521321190300850110085．7195．9703152142100006020098．7095．950．684122112220052040091．7398．251．47513813300610000000100．0068．5606109940333040000093．9774．02079890134016040092．4590．000．6988635000056080086．8785．370

1)對照蠶卵區(qū)號1～8的滯育卵數(shù)分別為91、92、145、134、116、158、144、183粒。

2.4 HCl對蠶卵表面的刻蝕效果

HCl處理后不同時期的桑蠶卵殼表面掃描電鏡的結(jié)果如圖1所示。HCl處理后的卵殼表面具有明顯的刻蝕痕跡，卵殼表面有類似“脂質(zhì)”脫落的表現(xiàn)，且產(chǎn)后20 h HCl溶液處理后立即就能觀察到，48 h樣品中觀察到大量“脂質(zhì)”脫落，72 h的樣品中盡管能觀察到一些脫落物，但是量明顯減少 (圖2A～2C) ；在對照組不同時期的蠶卵中，蠶卵表面均未能發(fā)現(xiàn)明顯的刻蝕現(xiàn)象(圖2D～2F)。此外，在HCl處理和對照組的卵殼表面都有少量白色裂痕出現(xiàn)。

A～C分別為HCl處理組產(chǎn)卵后20、48、72 h卵殼表面，D～F分別為對照組產(chǎn)卵后20、48、72 h卵殼表面，圖中寬箭頭示裂痕，窄箭頭示脫落的脂質(zhì)。

圖1 HCl處理后桑蠶卵殼表面電鏡觀察
Fig.1 SEM Observation on eggshell surface after HCl treatment

2.5 DMSO對蠶卵表面的刻蝕效果

在產(chǎn)后12 h DMSO處理后，從掃描電鏡的圖片可以看出，桑蠶卵殼具有明顯的刻蝕痕跡，有類似“脂質(zhì)”的碎片分布在卵殼的表面。產(chǎn)后48 h觀察到大量的“脂質(zhì)”碎片脫落，72 h的樣品仍然能觀察到，而對照組中均未出現(xiàn)蝕刻的現(xiàn)象(圖2)。與HCl處理一樣，DMSO處理的桑蠶卵殼表面也觀察到了裂痕現(xiàn)象。

A～C分別為DMSO處理組產(chǎn)卵后12、48、72h卵殼表面,D～F分別為對照組產(chǎn)卵后12、48、72h卵殼表面,圖中寬箭頭示裂痕，窄箭頭示脫落的脂質(zhì)。

圖2 DMSO處理后桑蠶卵殼表面電鏡觀察
Fig.2 SEM observation on eggshell surface after DMSO treatment

2.6 HCl對蠶卵表面氣孔的影響

蠶卵氣孔的變化如圖3所示，HCl處理后的蠶卵氣孔明顯增大。對照滯育卵的氣孔與處理后的蠶卵起初差異并不大，但是隨著時間的推移，9 d后氣孔已經(jīng)顯著縮小，此時，對照組的蠶卵已經(jīng)完全進入滯育，呼吸、代謝等顯著下降。

A～E分別為HCl處理組產(chǎn)卵后20、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔，F(xiàn)-J分別為對照組產(chǎn)卵后20、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔，白色箭頭示氣孔。

2.7 DMSO對蠶卵表面氣孔影響

DMSO處理組在產(chǎn)卵后48 h內(nèi)的卵殼氣孔變化不大，大約在產(chǎn)后72 h差異逐漸顯現(xiàn)，9 d時(孵化前)差異明顯。在卵產(chǎn)下12 h對照和處理的蠶卵氣孔幾乎無差異，此時對照組蠶卵還未進入滯育，呼吸量跟活化蠶卵無差異。隨著時間的推移，對照組在9 d的時候氣孔顯著縮小，蠶卵已經(jīng)完全進入滯育。就對卵殼氣孔的影響程度而言，與HCl處理相比較，DMSO處理略顯平緩。

A～E分別為DMSO處理組產(chǎn)卵后12、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔,F～J分別表示對照組產(chǎn)卵后12、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔,白色箭頭示氣孔。

圖4 DMSO處理后桑蠶卵殼氣孔電鏡觀察
Fig.4 SEM observation on eggshell aeropyle after DMSO treatment

3 討論和結(jié)論

本研究中HCl和DMSO處理桑蠶蠶卵分別獲得了93.37%和87.81%的平均孵化率，高于日本學(xué)者Yamamoto用DMSO處理的試驗結(jié)果，在試驗方法相同的情況下，可能是由供試蠶品種的不同造成的，Yamamoto的試驗中樣本量是100～150粒蠶卵[6]，跟本研究的8個蛾圈，每個蛾圈大約110粒蠶卵的樣本量比較起來樣本偏小，這可能也是導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)一定程度偏差的原因。有學(xué)者主張以轉(zhuǎn)青率作為衡量阻斷滯育是否成功的標準，因為可能有許多因素共同作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)青卵不孵化[8]，這樣轉(zhuǎn)青率顯然高于孵化率。本試驗表明2種方法均能成功阻斷滯育，為電鏡觀察提供了依據(jù)。

卵殼表面的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，2種方法處理后的蠶卵表面都有“脂質(zhì)”脫落物出現(xiàn)。吳大洋[9-10]通過對卵殼脂質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定了2種高級醇的乙酸酯，其在滯育卵和非滯育卵的卵殼中的含量存在顯著差異，滯育卵卵殼的脂質(zhì)含量明顯高于非滯育卵，并且在滯育卵的發(fā)育過程中2種乙酸酯的含量交替變化，推斷這些差異和變化是導(dǎo)致滯育的關(guān)鍵原因；更為重要的是，鹽酸處理會導(dǎo)致滯育卵2種乙酸酯含量顯著減少，促使蠶卵滯育被阻斷轉(zhuǎn)而活化。

關(guān)于DMSO阻斷滯育的機理，Yamamoto推測可能是通過卵殼滲透入蠶卵的某種化學(xué)物質(zhì)加強了酶抑制劑的運輸能力，從而誘導(dǎo)活化[6]，但缺乏更多的試驗證明。就本研究而言，HCl和DMSO處理對卵殼外部蝕刻作用是顯而易見的。此外，處理和對照的卵殼上均出現(xiàn)了裂痕，我們認為這是在制片過程中蠶卵卵殼受到物理擠壓而出現(xiàn)的現(xiàn)象，與HCl和DMSO的處理沒有直接關(guān)系。

昆蟲胚胎發(fā)育階段，氣孔作為氣體交換的重要通道，會隨著發(fā)育進程有一系列變化。其中，最為典型的是氣孔直徑大小的變化。較大的家禽卵已有觀察到其卵殼氣孔隨胚胎的發(fā)育逐漸增大的報道[11-12]。昆蟲中的相關(guān)研究大多是比較幾種昆蟲卵殼外部形態(tài)特征的報道[13-14]，但對桑蠶等昆蟲胚胎發(fā)育階段卵殼氣孔變化的報道較少。Woods等[15]研究了煙草天蛾Manducasexta卵殼氣孔的直徑大小及密度，其研究結(jié)果與本結(jié)果基本一致，即隨著胚胎的發(fā)育，卵殼氣孔逐漸增大。對其他昆蟲和魚類的研究表明氧氣的消耗量與滯育的終止有極其重要的聯(lián)系[16-17]，桑蠶卵的氧氣消耗量與山梨糖醇的利用率相關(guān)[18]。

本研究驗證了Yamamoto關(guān)于烷類試劑DMSO也能阻斷蠶卵滯育的研究，通過電鏡觀察了HCl和DMSO阻斷滯育后，蠶卵胚胎發(fā)育過程中卵殼表面出現(xiàn)脂質(zhì)脫落物和氣孔大小發(fā)生的變化。這些結(jié)果為探討滯育阻斷機理提供了生動、形象的表觀特征，但這種現(xiàn)象與滯育阻斷的機制是否存在直接關(guān)系尚待更多的生理生化以及分子生物學(xué)試驗驗證。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

SEM observation on silkworm eggshell under HCl or dimethyl sulfoxide(DMSO) treatment for preventing diapause

GONG Jing, TIAN Sha, HOU Yong, ZHAO Huanhuan, ZHU Yong

(College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China)

【Objective】 To investigate the diapause prevention mechanism of silkworm (Bombyxmori)，and compare a series of changes of eggshell surface after diapause prevention by HCl or DMSO treatment. 【Method】The eggs were treated with HCl or DMSO at 20 and 12 h after oviposition respectively. Scanning electron microscope (SEM) was used to observe the changes of eggshell surface and aeropyle at different time points after treatment. 【Result】Both HCl and DMSO treatments successfully prevented the occurrence of egg diapause, and the average hatching rates were 93.37% and 87.81% respectively. SEM observation showed clear etching effect and “l(fā)ipid” shed on eggshell surface, and the aeropyle diameter increased gradually under both treatments. The above observations were more obvious for the HCl treatment compared with the DMSO treatment. 【Conclusion】Eggshell surface changes may be related to the diapause prevention of silkworm.

silkworm; diapause prevention; HCl; DMSO; scanning electron microscopy; eggshell

2016- 07- 11優(yōu)先出版時間：2017-01-10

龔 競(1980—)，女，實驗師，博士研究生，E-mail:03gongjing@163.com；通信作者：朱 勇(1961—)，男，教授，博士，E-mail: zhuy@swu.edu.cn

973計劃 (2012CB114600)；國家自然科學(xué)基金 (31201853) ；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃(cstc2015jcyA0469)

S828

A

1001- 411X(2017)02- 0001- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170110.1423.018.html

龔 競， 田 莎， 侯 勇， 等.HCl和DMSO阻斷滯育條件下桑蠶卵殼電鏡觀察[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(2):1- 5.