趙豐舟，劉震，侯巨梅，崔佳，左豫虎，劉銅

（黑龍江八一農墾大學農學院植物病理與應用微生物研究所，黑龍江大慶163319）

玉米彎孢葉斑病菌Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑的相關基因鑒定與結構特征分析

趙豐舟，劉震，侯巨梅，崔佳，左豫虎，劉銅

（黑龍江八一農墾大學農學院植物病理與應用微生物研究所，黑龍江大慶163319）

植物病原真菌Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑在調控病原菌附著胞形成和致病性等方面起重要作用。為了明確Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑在玉米彎孢葉斑病菌中的調控作用，筆者采用生物信息學方法，對玉米彎孢葉斑病菌全基因組中的Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑的相關基因進行鑒定并對其分子結構特征分析。結果表明：從玉米彎孢葉斑病菌中鑒定出Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑中3個蛋白激酶基因Clf、Map2k、Clk1和一個錨定蛋白基因ClSte50。蛋白序列分析以及進化樹構建等表明它們分別與來源其他植物病原真菌的Fus3/Kss1-MAPK途徑中的激酶蛋白和錨定蛋白具有相似的結構特征和保守結構域，有較高同源性和較近的親緣進化關系。玉米彎孢葉斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途徑的相關蛋白激酶Clk1、Map2k、Clf和錨定蛋白Clste50與其他真菌Fus3/Kss1-MAPK途徑的相關蛋白結構相似，推斷有相似的功能。

彎孢葉斑病菌；Fus3/Kss1-MAPK；級聯途徑；結構特征

0 引言

由新月彎孢[Curvularia lunata(Wakker)Boed]引起的玉米彎孢葉斑病已成為一種重要的葉部病害，對中國玉米生產造成了嚴重的損失[1-3]。由于目前藥劑防治效果較差，在防治該病主要推廣抗病品種為主。然而，研究發(fā)現‘玉米彎孢葉斑病菌’存在明顯的生理分化和致病性變異[4-5]，一旦抗病品種喪失抗性，將直接威脅玉米生產安全。因此深入開展該菌致病性調控機理，可為設計新藥劑提供新的靶位點，為持久，有效的防治該病奠定基礎。隨著對該病原菌致病機理的深入研究，發(fā)現環(huán)化腺普酸(cAMP)信號途徑[6]、絲分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導途徑[5]和Ca2+信號途徑[6]在致病性中起重要的調控作用。其中MAPK級聯途徑由三級酶聯反應系統MAPKKK(mitogen activated protein kinase kinase kinase)-MAPKK(mitogen activated protein kinase kinase)-MAPK(mitogen activated protein kinase)所構成，最終通過激活MAPK激酶調控下游一系列基因表達來感應外境的信號，成為信號通路中研究最熱點的問題。在植物病原真菌至少存在Slt2-MAPK途徑、Hog1-MAPK和Fus3/Kss1-MAPK三條級聯途徑，其中Fus3/Kss1-MAPK途徑在對病菌附著孢形成、分生孢子產生和致病性等方面有重要的調控作用[7]。例如在‘黃瓜炭疽病菌’(Colletotrichum orbiculare)中，Fus3/ Kss1-MAPK途徑中的comekk1和cmk1基因敲除時其突變體增加了對高滲透壓的敏感性[9]。在玉米小斑病菌中(Bipolaria maydis)，Fus3/Kss1-MAPK途徑中ChSte11和Chk1基因可以調控分生孢子產生[10-11]。在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)中，發(fā)現了與Ste11-Ste7-Fus3/Kss1同源途徑Mst11-Mst7-PMK1，對該途徑中各個基因敲除時發(fā)現病菌不能產生附著孢和喪失致病性[7]。值得注意的是在‘釀酒酵母’(S.cerevisiae)中發(fā)現Fus1-MAPK和Slt2-MAPK級聯途徑可以與一些錨定蛋白互作，共同調控其生理功能。例如Fus1-MAPK級聯途徑發(fā)現一個錨定蛋白Ste5，它可以與Ste11、Ste7和Fus3互作調控交配與外激素反應途徑[10]。2006年Park等[12]在‘稻瘟病菌’Mst11-Mst7-Pmk1途徑中發(fā)現一個錨定蛋白Mst50，它可直接與Mst11和Mst7互作激活Pmk1基因調控附著孢形成和致病性，結果表明在Fus3/Kss-MAPK級聯途徑中可能存在一個與其互作的錨定蛋白，與級聯途徑共同來調控一些重要的生物學功能。生物信息學采用計算機方法實現分子數據的挖掘以及新的數據庫的建立和發(fā)展，可以合理預測基因和蛋白質的序列信息，為分子數據分析提供了便利并得到廣泛的應用。玉米彎孢葉斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途徑與稻瘟病菌和玉米小斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途徑有不同的調控功能，可能與該病菌的無性產孢和致病性有關。目前Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑在玉米致病菌新月彎孢侵染中的作用還未見報道。因此采用生物信息學的方法獲得Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑中蛋白激酶基因和錨定蛋白基因，對其分子結構特征進行分析，為下一步開展玉米彎孢葉斑菌Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑的調控功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 Fus3/Kss1-MAPK途徑相關蛋白鑒定和序列分析

從NCBI數據庫下載玉米致病菌新月彎孢(C. lunata)基因組(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ JFHG00000000)，利用BioEdit構建當地核苷酸和預測的蛋白質數據庫。查詢NCBI數據庫和相關文獻，獲得釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中Fus3/Kss1-MAPK途徑中各蛋白質的氨基酸序列。以釀酒酵母(S.cerevisiae)和稻瘟病菌(M.oryzae)中Fus3/Kss1-MAPK途徑中各蛋白的氨基酸序列為查詢序列，設其E＜10-100，將從玉米彎孢葉斑病菌的蛋白質數據庫中獲取各自相應的蛋白質序列為侯選蛋白質序列。將這些侯選蛋白質序列提交到NCBI的在線工具CDD Search和SMART進行保守區(qū)域分析。

1.2 蛋白序列分析和進化樹構建

從NCBI數據庫中下載來源其他真菌的Fus3/ Kss1-MAPK途徑中一些相應蛋白序列，分別與相應的侯選蛋白序列構成比對文件。采用Clustal W2程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對這些比對文件進行分析，并輸出到GENEDOC軟件，分析其保守結構位點。采用MEGA5(http://megasoftware.net）軟件進行系統發(fā)育進化樹的構建，所用方法為鄰近比較法。

2 結果與分析

2.1 Fus3/Kss1-MAPK途徑相關蛋白鑒定

以釀酒酵母(S.cerevisiae)Fus3/Kss1-MAPK途徑中Kss1(P14681.1)和Fus3(P16892.2)蛋白和稻瘟病菌PMK1(AAC49521.2)序列查詢玉米彎孢葉斑病菌蛋白質數據庫，獲得E值最高的蛋白質序列CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_10006419，它分別與Kss1、Fus3和PMK1 E值為e-122、e-125和0，并且通過數據庫查詢，與以前發(fā)表的Clk1蛋白序列一致。表明該蛋白質可能為Fus3/Kss1-MAPK途徑中MAPK激酶。同樣以釀酒酵母(S.cerevisiae)和稻瘟病菌Fus3/ Kss1-MAPK途徑中Ste7、Ste11、Ste50蛋白查詢玉米彎孢葉斑病菌(C.lunata)蛋白數據庫，分別獲得相應的高度同源的蛋白質序列CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10010900、CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10009411和CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10006042。其中CURfmnDABDK AAPEI_GLEAN_ 10010900和CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10009411氨基酸序列與數據庫中已經命名為Map2K和Clf氨基酸序列相同，另CURfmnDABD KAAPEI_GLEAN_10006042被命名為ClSte50。將這4個氨基酸序列提交到NCBI的在線工具CDD Search和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析，發(fā)現Clk1和MAP2K含有激酶激活區(qū)，Clf與Ste11一樣具有蛋白與蛋白相作區(qū)SAM、Ras結合區(qū)和激酶激活區(qū)，ClSte50與來源其他真菌的Ste50一樣含有蛋白與蛋白相作區(qū)SAM和Ras結合區(qū)。4個相關蛋白其相關信息顯示如表2和圖1。

為進一步了解Fus3/Kss1-MAPK途徑中蛋白的序列特征，采用Clustal X軟件對3個激酶蛋白進行序列多重比對，結果表明，Clk1基因與所有MAPK家族一樣含有“TEY”磷酸化唇保守結構域，以及蛋白激酶活性位點“D[L/I/V]K”（圖2-A）。Map2k基因與其他真菌的Ste7一樣，除含蛋白激酶活性位點“D[L/I/V]K”外，還具有SDIWS特征序列（圖2-B）。Clf基因與其他來源真菌的Ste11一樣含有“GSVFWMAPE”特征結構序列（圖2-C）。

表1 來自玉米彎孢葉斑病菌(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途徑相關基因信息

圖1 玉米彎孢葉斑病菌(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途徑相關基因保守結構域

為了進一步了解4個蛋白的進化來源和親緣關系分析，分別下載了來源其他真菌的Fus3/Kss1-MAPK途徑相關的蛋白進行遺傳進化關系分析，結果顯示表明Clk1與‘稻瘟病菌’的PMK1處于一個大的分支上，與‘鏈格孢’(Alternaria alternate)Fus3和‘玉米小斑病菌’(Bipolaria maydis)Pmk1親緣關系最近（圖3-A）。Map2k與‘稻瘟病菌’的Ste7處于一個大的分支上，與‘小新殼梭孢’(Neofusicoccum parvum)Ste7親緣關系最近（圖3-B）。Clf與‘玉米小斑病菌’和‘稻瘟病菌’Ste11處于同一個分支，具有一定的親緣關系（圖3-C）。ClSte50與‘玉米大斑病菌’的一個假定蛋白處于同一個小分支上，與‘稻瘟病菌’Ste50親緣關系較近（圖3-D）。由于相似的結構具有一定相似功能，同源蛋白具有相同的生物學功能，根據以上所有結果分析，明確玉米彎孢葉斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途徑3個蛋白激酶基因分別為Clf、Map2k、Clk1和一個相關錨定蛋白為ClSte50。

圖2 ‘玉米彎孢葉斑病菌’(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途徑激酶保守結構域氨基酸序列比對

3 結論

筆者采用生物信息學方法首次對玉米彎孢葉斑病菌基因組的Fus3/Kss1-MAPK途徑相關蛋白進行了分析與鑒定。Clk1基因擁有MAPK家族一樣的“TEY”磷酸化唇保守結構域，與玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)Pmk1親緣關系最近；Map2k基因與其他真菌的Ste7一樣，具有SDIWS特征序列，與小新殼梭孢(Neofusicoccum parvum)Ste7親緣關系最近；Clf基因含有Ste11基因的特征結構序列“GSVFWMAPE”，與玉米小斑病菌和稻瘟病菌Ste11處于同一個分支，具有一定的親緣關系；ClSte50與稻瘟病菌Ste50親緣關系較近。由于Fus3/Kss1-MAPK途徑的相關蛋白激酶Clk1、Map2k、Clf和錨定蛋白Clste50分別與其他真菌的Fus3/Kss1-MAPK途徑的相關蛋白結構相似，因此推斷其功能相似。

4 討論

植物病原真菌中至少存在3條MAPK途徑，分別與‘釀酒酵母’(S.cerevisiae)的Fus3/Kss1-MAPK、Slt2-MAPK和Hog-MAPK途徑有較高的同源性，各種途徑在功能上相互獨立，又具有一定重疊和協同作用，并且每種途徑的功能在不同的植物病原真菌中存在較大的差異[13]。例如在稻瘟病菌中Osm1基因（與酵母Hog1同源）負責調控滲透壓[14]，Mps1（與酵母Slt2同源）基因調控侵染釘與分生孢子的形成和細胞壁的完整性[15]；而在玉米小斑病菌中Mps1則可以調控病菌黑色素、毒性和分生孢子產生和病菌自溶，Hog1基因主要調節(jié)滲透壓和氧壓、附著孢形態(tài)和致病性[16]。稻瘟病菌中Pmk1（與酵母Fus3/Kss1基因同源）調控附著胞的形成、侵入絲的生長和致病性[17]；在玉米小斑病菌的Pmk1可調控疏水蛋白、黑色素、次生代謝產物的形成[18]；然而研究報道玉米彎孢葉斑病菌中Clk1基因缺失可以影響病菌分生孢子產生和致病性[19]，Clf基因敲除病菌不能正常產孢（未發(fā)表），這些結果表明玉米彎孢葉斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途徑與稻瘟病菌和玉米小斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途徑有不同的調控功能，可能與該病菌的無性產孢和致病性有關。因此開展玉米彎孢葉斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途徑研究，將有助于探索MAPK途徑對玉米彎孢葉斑病菌產孢和致病性調控機理，將為研制新型殺菌劑提供新的更多的靶位點。

圖3 ‘玉米彎孢葉斑病菌’(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途徑相關蛋白系統進化樹

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Identification and Structure Characteristics of Related Genes of Fus3/Kss1-MAPK Pathway from Curvularia lunata

Zhao Fengzhou,Liu Zhen,Hou Jumei,Cui Jia,Zuo Yuhu,Liu Tong

(Institute of Plant Pathology and Applied Microbiology,College of Agronomy,Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319,Heilongjiang,China)

The cascade pathway of Fus3/Kss1-MAPK in plant pathogenic fungi plays an important role in regulating appressorium development and pathogenicity.In order to investigate the role of Fus3/Kss1-MAPK cascade pathway in‘Curvularia lunata’,we used bioinformatics methods to identify the related gene of the Fus3/Kss1-MAPK cascade pathway from‘Curvularia lunata’in genome-wide and analyzed the molecular structure characteristics of Fus3/Kss1-MAPK related gene.The result showed that three protein kinases genes of Clf,Map2K,Clk1 and an ankyrin gene Clste50 were identified based on genome of‘Curvularia lunata’.The protein sequence analysis and phylogenetic tree construction showed that Clf,Map2k,Clk1 and Clste50 in‘Curvularia lunata’all contained similar structural features and conservative domains with those of other plant pathogenic fungi,and had high homology and close phylogenetic relationships.The related protein kinases genes Clf,Map2K,Clk1 and an ankyrin gene Clste50 of the Fus3/Kss1-MAPK cascade pathway from‘Curvularia lunata’were similar to the protein structures with other fungi.Those results may indicate that they have similar function in appressorium development and pathogenicity.

Curvularia lunata;Fus3/Kss1-MAPK;Cascade Pathway;Structure Characteristics

S435.131

A論文編號：cjas16030014

黑龍江八一農墾大學研究生創(chuàng)新科研項目“玉米彎孢葉斑病菌多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因鑒定及其在致病性中的作用研究”(YJSCX2015-Y06)；國家自然科學基金資助項目“基于microRNA的抗玉米彎孢葉斑病分子調控機理研究”(31272026)。

趙豐舟，女，1987年出生，黑龍江綏化人，研究生，研究方向為分子植物病理學。通信地址：163319黑龍江八一農墾大學農學院植物病理與應用微生物研究所，Tel：0459-6819133，E-mail：521zhaofengzhou@163.com。

左豫虎，男，1965年出生，河南新鄭人，教授，博士，主要從事植物病理學研究。通信地址：163319黑龍江八一農墾大學農學院，Tel：0459-6819133，E-mail：zuoyhu@163.com；劉銅，男，1978年出生，江西萍鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事玉米病害研究。通信地址：163319黑龍江八一農墾大學農學院，E-mail：liutongamy@sina.com。

2016-03-16，

2016-06-21。