邢 進(jìn)，馮育芳，岳秉飛，賀爭鳴*，孫曉梅，代解杰

(1. 中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118)

巴斯德桿菌屬CODEHOP PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

邢 進(jìn)1，馮育芳1，岳秉飛1，賀爭鳴1*，孫曉梅2，代解杰2

(1. 中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118)

目的 建立巴斯德桿菌的CODEHOP PCR快速檢測方法，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的呼吸道細(xì)菌的控制提供參考。 方法 應(yīng)用CODEHOP在線簡并引物設(shè)計(jì)工具，比對(duì)Genbank中13株巴斯德桿菌的RNA聚合酶β亞基(rpoB)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物。對(duì)建立CODEHOP PCR方法用21株參考菌株進(jìn)行特異性和敏感性評(píng)價(jià)，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的巴斯德桿菌檢測。 結(jié)果 簡并引物PastF6/PastR5擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)菌株的目的片段為200 bp左右。能夠區(qū)分受試的巴斯德桿菌和主要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸道病原菌。敏感性為0.2 pg/μL～2 pg/μL。在受試的609只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中呼吸道樣品中檢測出巴斯德桿菌陽性率為19.1%。樣品陽性片段經(jīng)測序驗(yàn)證，準(zhǔn)確率為100%。 結(jié)論 所建立的方法具有良好的特異性和敏感性，可用于動(dòng)物樣品中巴斯德桿菌的檢測。

巴斯德桿菌；共有序列簡并雜合寡核苷酸引物；PCR檢測；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

巴斯德桿菌屬(Pasteurellaspp.)是一群革蘭氏陰性，不抗酸、不運(yùn)動(dòng)、無芽孢的短桿菌或球桿菌，絕大部分存在于動(dòng)物呼吸道粘膜，特別是在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸道中普遍存在。本屬菌株表型特征相近[1]，大部分菌株為條件致病菌，以嗜肺巴斯德桿菌和多殺巴斯德桿菌較為常見，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物國家標(biāo)準(zhǔn)中SPF級(jí)動(dòng)物需排除的病原菌[2]。感染發(fā)病時(shí)，以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，根據(jù)具體感染部位的不同可引起各種炎癥，如肺炎、皮炎、眼炎、結(jié)膜炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎等[3]。與仙臺(tái)病毒、腺病毒、支原體、支氣管鮑特桿菌等合并感染，更會(huì)加重感染癥狀，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造成不可忽視的影響[4-5]。

與我國標(biāo)準(zhǔn)不同，歐盟實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聯(lián)合會(huì)(FELASA)的檢測標(biāo)準(zhǔn)中需要檢測巴斯德菌科(Pasteurellaceae)中的所有菌株。在巴斯德菌科中，除巴斯德桿菌屬外，放線桿菌屬(Actinobacillus)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、曼海姆菌屬(Mannheimia)等菌屬的菌株在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中也比較常見，其形態(tài)和基因組序列相似度高，不易區(qū)分。根據(jù)我國的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物控制現(xiàn)狀，短期內(nèi)排除所有巴斯德菌科菌株并不現(xiàn)實(shí)，因此首先從排除影響大、感染率最高的巴斯德桿菌屬著手，建立有效的菌屬檢測方法。本研究旨在采用共有序列簡并雜合寡核苷酸引物(consensus degenerate hybrid oligonucleotide primers，CODEHOP)PCR方法[6，7]，建立針對(duì)巴斯德桿菌屬的快速檢測方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

本研究共采用21株參考菌株，依據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)[8]和美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)的分類，其中巴斯德菌科菌株16株，5株巴斯德桿菌(表1)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸道樣本

小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠呼吸道樣品取自2015年北京市會(huì)檢，沙鼠呼吸道樣品采自普通環(huán)境生長的長爪沙鼠，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(浙)2014-0034]和首都醫(yī)科大學(xué)[SCXK(京)2015-0009]提供。樹鼩呼吸道樣品采自昆明滇西亞種野生馴化樹鼩咽拭子及氣管，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供[SCXK(滇)K2013-0001]。

表1 參考菌株

注：(ATCC)美國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保藏中心；(CMCC)中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

Note.(ATCC)American Type Culture Collection.(CMCC)National Center for Medical Culture Collection.

1.2 主要試劑與儀器

哥倫比亞血瓊脂(OXIOD)；無菌脫纖維羊血(北京路橋生物技術(shù)有限公司)；GC瓊脂(BD)，肺炎支原體肉湯(北京三藥科技開發(fā)有限公司)；DNA提取試劑盒(Qiagen)；PCR試劑(TAKARA)；，瓊脂糖(TAKARA)。

恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo IGS180)；冷凍離心機(jī)(美國Thermo X1R)；超微量分光光度計(jì)(德國NanoPhotometer)；PCR儀(美國ABI veriti96)；電泳儀(美國伯樂Powerpac HC)；紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國Kodak GL212pro)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種復(fù)蘇與DNA提取

巴斯德桿菌及其他參考菌種接種于哥倫比亞血瓊脂平皿，至36℃培養(yǎng)24 h；嗜血桿菌接種于GC培養(yǎng)基，36℃微需氧培養(yǎng)48 h；肺炎支原體接種于肺炎支原體肉湯培養(yǎng)基36℃厭氧培養(yǎng)5 d；根據(jù)試劑盒說明提取各參考菌株的基因組DNA，凍存與-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

將13株Genbank中獲得的巴斯德桿菌rpoB氨基酸序列(表2)通過CODEHOP在線引物設(shè)計(jì)工具(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html)[10]設(shè)計(jì)簡并引物。巴斯德桿菌rpoB氨基酸序列經(jīng)分析后，被分為了三個(gè)保守的區(qū)域，從中選擇高分、低簡并度的引物，最終篩選出上游引物PastF6：5’-GGTGAACGGCCAGGTGacngargarat-3’和下游引物PastR5：5’-CTGGGTGGACACGTCCatrtartgdat-3’(圖1)。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 P-選簡并引物PastF6和PastR5Fig.1 CODEHOP primer pair PastF6 and PastR5

1.3.3 PCR體系及條件

PCR體系為20 μL：10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(10 μM)1.6 μL，1 U的Taq HS DNA聚合酶(5 U/μL)，PastF6/R5(10 μM)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，滅菌水14.2 μL。反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后確定：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖在0.5%TBE中120 V電泳40 min，并將陽性片段送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.4 特異性檢測

對(duì)5株巴斯德桿菌及16株它屬菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測非巴斯德菌有無目的片段產(chǎn)生，特異性條帶進(jìn)行測序和Blast比對(duì)驗(yàn)證。

1.3.5 敏感性檢測

提取5株巴斯德桿菌的DNA，核酸濃度均調(diào)整至20 ng/μL，分別做10倍系列稀釋至10-6，共7個(gè)稀釋度(20 ng/μL～20 fg/μL)，對(duì)本PCR方法進(jìn)行敏感性檢測。

1.3.6 方法應(yīng)用檢測

用DNA提取試劑盒提取呼吸道樣品的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。部分PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序和Blast比對(duì)，驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)對(duì)相同樣品進(jìn)行血瓊脂分離培養(yǎng)，將結(jié)果進(jìn)行比較。樹鼩取樣操作在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種屬資源中心進(jìn)行[SYXK(滇)K2013-0001]，其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作在中國食品藥品檢定研究院進(jìn)行[SYXK(京)2011-0008]。

2 結(jié)果

2.1 方法的建立與特異性結(jié)果

根據(jù)引物的配對(duì)組合結(jié)果，PastF6/R5引物對(duì)能夠較特異性的擴(kuò)增出5株巴斯德桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。而且均擴(kuò)增出單一的200 bp左右目的條帶(圖2)。目的片段經(jīng)測序和 Blast比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，結(jié)果相符(表3)。

注：(1、23)100 bp DNA Marker; (2)嗜肺巴斯德桿菌ATCC12555；(3)嗜肺巴斯德桿菌ATCC35149；(4)多殺巴斯德桿菌ATCC43137；(5)產(chǎn)氣巴斯德桿菌ATCC27883；(6)達(dá)科馬巴斯德桿菌ATCC43325；(7)雞禽桿菌ATCC13361；(8)脲放線桿菌ATCC25976；(9)副雞禽桿菌ATCC29545；(10)鳥禽桿菌ATCC29546；(11)溶血曼海姆桿菌ATCC33369；(12)溶血嗜血桿菌ATCC33390；(13)流感嗜血桿菌ATCC33391；(14)副流感嗜血桿菌ATCC33392；(15)杜克雷嗜血桿菌ATCC33940；(16)肉芽腫曼海姆菌ATCC49244；(17)小鼠放線桿菌ATCC49577；(18)支氣管鮑特桿菌ATCC19395；(19)肺炎鏈球菌CMCC36001；(20)乙型溶血性鏈球菌CMCC32210；(21)鼠棒狀桿菌CMCC65013；(22)肺炎支原體ATCC15531。圖2 P-選引物PastF6/R5特異性試驗(yàn)結(jié)果Note.(1、23)100 bp DNA Marker. (2) P.neumotropica ATCC12555. (3) P.pneumotropica ATCC35149. (4)P.multocida ATCC43137. (5)P.aerogenes ATCC27883. (6) P.dagmatis ATCC43325. (7)A.gallinarum ATCC13361. (8) A.ureae ATCC25976. (9) A. paragallinarum ATCC29545. (10)P.avium ATCC29546. (11) M.haemolytica ATCC33369. (12) H.haemolyticus ATCC33390. (13) H. influenza ATCC33391. (14) H.parainfluenzae ATCC33392. (15) H.ducreyi . (16) M.granulomatis ATCC49244. (17) A.muris ATCC49577. (18) B.bronchiseptica ATCC19395. (19) S.pneumoniae CMCC36001. (20) S.hemolytis-β CMCC32210. A.faecalis ATCC8750, S.pullorum CMCC50047, P.mirabilis DJ150030, B.cereus CMCC63301. (21) C.Kutscheri CMCC65013. (22) M.pneumoniae ATCC15531.Fig.2 Specific result of primers PastF6/R5 amplified reference strains

標(biāo)準(zhǔn)菌株Standardstains片段長度(bp)Fragmentlength登錄號(hào)Accession相似度(%)Ident嗜肺巴斯德桿菌Jawetz型P．neumotropicabiotypeJawetz199AB461843198嗜肺巴斯德桿菌Heyl型P．neumotropicabiotypeHeyl198GU809196199多殺巴斯德桿菌P．multocida201CP008918197產(chǎn)氣巴斯德桿菌P．a(chǎn)erogenes199AY314040196達(dá)科馬巴斯德桿菌P．dagmatis200AY362966196雞禽桿菌A．gallinarum198JN592558196鳥禽桿菌P．a(chǎn)vium202AY362965196

2.2 敏感性結(jié)果

用引物PastF6/R5分別擴(kuò)增5株巴斯德桿菌參考菌株DNA，不同菌株的敏感性結(jié)果有所不同(圖3)。檢測嗜肺巴斯德桿菌和產(chǎn)氣巴斯德桿菌的檢測限可達(dá)0.2 pg/μL；多殺巴斯德桿菌和達(dá)科馬巴斯德桿菌的檢測限為2 pg/μL。

2.3 應(yīng)用檢測

用本方法檢測609只動(dòng)物呼吸道樣品，共有116份產(chǎn)生目的片段，巴斯德桿菌屬陽性率為19%，分離培養(yǎng)法鑒定出77份存在巴斯德桿菌，陽性率為12.6%(表4)。用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行NcNemar檢驗(yàn)，P< 0.001，兩種方法差異顯著；一致性檢驗(yàn)Kappa值=0.725，結(jié)果比較一致。對(duì)樹鼩的58份陽性片段(圖4)進(jìn)行測序和序列比對(duì)，結(jié)果中多殺巴斯德桿菌感染率為32/58，嗜肺巴斯德桿菌、達(dá)科馬巴斯德桿菌和產(chǎn)氣巴斯德桿菌各為1/58，其他未知巴斯德菌科菌株為23/58。除25份樣本為未知的巴斯德菌科菌株外，陽性結(jié)果準(zhǔn)確率100%。

注：(a)菌株ATCC12555；(b)菌株ATCC27883；(c)菌株ATCC25149；(d)菌株ATCC43137；(e)菌株ATCC43325；(1)100bp DNA Marker；(2～8)模板濃度分別為20 ng/μL～20 fg/μL；(9)空白對(duì)照。圖3 引物PastF6/R5敏感性檢測結(jié)果Note.(a)Strain ATCC12555.(b)Strain ATCC27883.(c)Strain ATCC25149.(d)Strain ATCC43137.(e)Strain ATCC43325.(1)100bp DNA Marker.(2～8)Template concentration of 20 ng/μL～20 fg/μL respectively.(9)Blank control.Fig.3 Sensibility results of primers PastF6/R5 amplified Pasteurella spp.

注：(M)100bp DNA Marker；(1～60)樹鼩呼吸道樣本；(61)多殺巴斯德桿菌陽性對(duì)照；(62)空白對(duì)照。圖4 樹鼩呼吸道樣品巴斯德桿菌檢測結(jié)果Note. (M)100bp DNA Marker. (1～60)Tree shrew respiratory tract samples. (61)P.multocida positive control. (62)Blank control.Fig.4 The results of Tree shrews Pasteurella test

動(dòng)物種類Species等級(jí)Level普通級(jí)CV清潔級(jí)CL無特定病原體級(jí)SPF總計(jì)Total小鼠Mice/9/100(7/100)5/150(3/150)14/250(10/250)大鼠Rats/2/60(0/60)0/50(0/50)2/110(0/110)豚鼠Guineapigs0/80(0/80)0/15(0/15)0/10(0/10)0/105(0/105)地鼠Hamster/0/20(0/20)/0/20(0/20)沙鼠Mongoliangerbil42/64(37/64)//42/64(37/64)樹鼩Treeshrew58/60(30/60)// 58/60(30/60)[9]

注：括號(hào)中為分離培養(yǎng)法陽性率。

Note. The content in round brackets is the positive rate of culture method.

3 討論

本研究利用CODEHOP 方法設(shè)計(jì)了巴斯德桿菌屬的簡并引物，在巴斯德菌科內(nèi)能夠排除絕大部分非巴斯德桿菌屬菌株。巴斯德桿菌屬、放線桿菌屬和嗜血桿菌屬僅通過16SrRNA很難進(jìn)行區(qū)分，根據(jù)此前的報(bào)道，rpoB蛋白能夠識(shí)別16SrRNA不能區(qū)分的巴斯德菌科菌株[10]，因此我們將RNA聚合酶的β亞基(rpoB)作為了目標(biāo)基因。所建立的PCR方法與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法相比較，具有更高的敏感性，被檢樣品的陽性率從12.6%提高到19.1%，不同種類動(dòng)物的檢出率均有提高。通過對(duì)目的片段的測序和序列比對(duì)，能夠快速的獲取目標(biāo)菌的種類，相比培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定具有更高的效率和可靠性。

雖然本方法能夠比較好的區(qū)分出巴斯德桿菌屬的菌株，但與禽桿菌屬菌株仍存在交叉反應(yīng)，與Christensen等[10]所報(bào)道的結(jié)果一致。伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(2004年第二版)中將狹義的巴斯德桿菌限制為多殺巴斯德桿菌、達(dá)科馬巴斯德桿菌、犬巴斯德桿菌和口腔巴斯德桿菌。禽類菌株曾經(jīng)歸屬于巴斯德桿菌屬，但在系統(tǒng)進(jìn)化上分屬于不同的分支[8]。在隨后的基因型和表型研究進(jìn)一步證實(shí)了禽類菌株的不同，對(duì)禽巴斯德桿菌P.gallinarum和雞巴斯德桿菌P.avium等4株菌重新進(jìn)行了分類，均歸屬于禽桿菌屬(Avibacteriumspp.)，并更名為A.gallinarum和鳥禽桿菌A.avium[11]。因此尋找巴斯德桿菌屬與禽桿菌菌株的之間的特異性差異片段仍需進(jìn)一步研究。

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Establishment and application of CODEHOP PCR assay for detection ofPasteurellaspp. in laboratory animals

XING Jin1, FENG Yu-fang1, YUE Bing-fei1, HE Zheng-ming1*, SUN Xiao-mei2, DAI Jie-jie2

(1. National Institute of Food and Drug Control, Institute of Laboratory Animal Resources, Beijing 100050, China; 2. Center of Tree Shrews Germplasm Resources，Institute of Medical Biology，CAMS and PUMC，Kunming 650118，China)

Objective We established a rapid detection method ofPasteurellaspp. and provided a reference for microbiological quality control of laboratory animal. Methods According to the β subunit of bacterial RNA polymerase (rpoB) protein multiple alignments of 13 differentPasteurellaspp. published in NCBI. The degenerate primers were designed by CODEHOP designer online. CODEHOP PCR method was applied to detectingPasteurellaspp. after the specificity and sensitivity of the method had been evaluated by 21 reference strains. Results Standard strain amplified fragment were about 200 bp by degenerate primers PastF6/PastR5. The primers are able to distinguish betweenPasteurellaspp. and the other pathognic organisms of laboratory animal respiratory tracts. Sensitivity of this method were 0.2 pg/μL～2 pg/μL to differentPasteurella. ThePasteurellapositive rate was 19.1% in 609 animal’s respiratory samples. The accuracy of positive results was 100% through verifying by sequenced and blast. Conclusions The established method has good specificity and sensitivity. It can be used to detectPasteurellaspp. in animal samples.

Pasteurellaspp.; CODEHOP; PCR detection; Laboratory animals

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAI01B01)。

邢進(jìn)(1979-)，男，副研究員。研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測。E-mail：xjvet@nifdc.org.cn

賀爭鳴(1957-)，男，研究員。研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)。E-mail：zhengminghe57@163.com

技術(shù)方法

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0085-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.017

2016-06-28