李 君，劉恩令，楊 麗

(唐山市工人醫(yī)院產(chǎn)科，河北 唐山 063000)

抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢腫瘤中的表達對卵巢癌的遷移、侵襲的影響

李 君，劉恩令*，楊 麗

(唐山市工人醫(yī)院產(chǎn)科，河北 唐山 063000)

目的 研究抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢腫瘤中的表達對卵巢癌的遷移侵襲的影響。方法 采用siRNA干擾IGFBP2、IGFBP3在卵巢癌細胞株SKOV3中的表達，CCK-8試劑盒檢測SKOV3的增殖情況，流式細胞術(shù)檢測SKOV3的凋亡情況，transwell實驗、細胞劃痕愈合實驗檢測SKOV3的遷移與侵襲；CCK-8法檢測不同濃度順鉑(5、10、20 μg/mL) 對SKOV3細胞生長的影響。結(jié)果 采用siRAN干擾IGFBP2、IGFBP3在卵巢癌SKOV3中表達后，與對照組相比SKOV3細胞增殖能力下降，凋亡增加，遷移與侵襲功能下降。結(jié)論 抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢腫瘤中的表達對卵巢癌的遷移與侵襲起一定的抑制作用。

IGFBP-2;IGFBP-3;卵巢癌;耐藥

卵巢癌在近幾年發(fā)病率明顯上升，對女性健康造成了極大的威脅。卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤,在女性中發(fā)病率占惡性腫瘤總數(shù)的4%。在女性生殖道癌瘤中卵巢惡性腫瘤發(fā)病率中占第2位,同時，卵巢惡性腫瘤占生殖道惡性腫瘤的22.90%。婦科的主要致死性疾病為卵巢上皮性癌,到目前為止，沒有有效的早期診斷方法，70%的病例在就診時已屬晚期，5年生存率低于30%[1]。在卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)許多基因異常表達，其中p53、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor,IGF)已發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中異常表達[2,3]。胰島素樣生長因子(insulin like growth factor, IGF) 家族在腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)化過程中正日益受到重視。胰島素樣生長因子系統(tǒng)由IGF及其受體和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin like growth factor binding protein,IGFBP)及IGFBP 蛋白酶組成，近來發(fā)現(xiàn)該家族與p53同樣參與細胞凋亡的調(diào)控及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢腫瘤中的表達，探討其對卵巢癌的遷移侵襲及耐藥的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

SKOV3細胞購自中科院上海生化細胞所；順鉑購自山東齊魯制藥有限公司；1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；Si-RNA IGFBP-2、Si-RNA IGFBP-3引物由廣州銳博生物有限公司合成；流式細胞凋亡Annexin V/PI雙染檢測試劑盒購自上海生工有限公司；transwell小室購自NEST公司;流式細胞儀購自BD生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

復蘇SKOV3細胞于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，并每天觀察細胞狀態(tài)，隔天換液傳代。

1.2.2 Si-RNA干擾實驗

(1)在6孔板中每孔接種2×105個細胞，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，放在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(2)當細胞融合度達到50%～80%時，在超凈臺中用無菌離心管中按照說明書配制溶液A和溶液B。將溶液A加入到溶液B中，輕輕吹打混勻，室溫孵育30 min。用2 mL左右PBS洗滌細胞，確保將血清全部洗去，每孔加入0.8 mL無血清培養(yǎng)基，將混合后的AB液滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，放在細胞培養(yǎng)箱中孵育8 h～12 h后換液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。(3)36 h～72 h后采用RT-PCR或Western blot檢測干擾的效果。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖

復蘇細胞進行培養(yǎng)，待細胞在大皿中呈指數(shù)期增長時進行種板(96孔板)，每孔接種細胞數(shù)2000個，待細胞貼壁后進行換液干擾實驗),分別在0 h和24 h時每孔加入10 uL CCK-8,設置對照組。細胞培養(yǎng)箱孵育4 h后，37℃搖床慢搖10分鐘用酶標儀測570 nm的OD值。

1.2.4 流式細胞術(shù)實驗

用胰酶消化細胞，每個樣本細胞數(shù)大約為5×105個，離心5 min后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2～3次,1000 r/min離心5 min棄去PBS后用100 μL的Bangdingbuffer重懸細胞，輕輕吹打均勻加入5 μL的PI,室溫下避光孵育10～15 min后(不要超過30 min)流式細胞儀檢測。

1.2.5 細胞劃痕實驗

(1)在6孔板背后，用marker筆均勻的劃橫線，橫線要橫穿過孔，可以用直尺比著，大約每隔0.5～1 cm一道。每個孔上面至少要劃5條線。(2)在每個孔中種下5×105個干擾或未干擾的細胞，具體數(shù)量要根據(jù)細胞的增殖情況決定，細胞過夜后融合度能夠達到80%～90%為宜。(3)第二天用槍頭劃痕，劃痕時槍頭要垂直，使得劃痕盡量垂至于背后的橫線。(4)用PBS洗細胞3次，加入無血清培養(yǎng)基放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在0 h，24 h時進行取樣，拍照。

1.2.6 transwell 實驗

提前一天用無血清無雙抗的1640培養(yǎng)基將transwell小室水化過夜，第二天消化收集干擾及未干擾的細胞，將細胞濃度調(diào)整到1×105/mL備用。輕輕吸去transwell上室內(nèi)液體，加入600 uL的完全培養(yǎng)基，同時在小室內(nèi)加入100 uL細胞懸液。在細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后取出transwell 小室，用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定10 min左右，用棉簽小心擦去微孔膜上層的細胞，用4 g/L臺盼藍溶液染色，在倒置顯微鏡下計數(shù)遷移到微孔膜下層的細胞。

1.2.7 順鉑耐藥實驗

將干擾或未干擾的細胞96孔板接種，每孔細胞數(shù)量為2000個，細胞貼壁后加入不同濃度的順鉑(5、10、20 μg /mL)，24 h后換液加入10 uL CCK-8,設置對照組。細胞培養(yǎng)箱孵育4 h后，37℃搖床慢搖10 min用酶標儀測570 nm的OD值。計算細胞存活率。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，兩組之間比較采用t檢驗，P< 0.05，表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染Si-IGFBP2，Si-IGFBP3效果

干擾SKOV3細胞中IGFBP2、IGFBP3后可以發(fā)現(xiàn)細胞中IGFBP2、IGFBP3的蛋白表達水平與對照組相比明顯降低。(見圖1)

圖1 轉(zhuǎn)染SiRNA IGFBP2，SiRNA IGFBP3效果Fig.1 The transfection effect of SiRNA IGFBP2，SiRNA IGFBP3

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3對SKOV3細胞增殖能力的影響

轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3后分別在0 h、24 h檢測了細胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0 h時轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3組的細胞增殖能力與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義，在24 h時轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3組的細胞增殖能力與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。(見圖2)

注：與對照組相比較，**P < 0.01，***P < 0.001。圖3 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞凋亡的影響(n=3) Note. Compared with the NC group，**P < 0.01，***P < 0.001.Fig.3 The apoptosis of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP-2, siRNA IGFBP-3

注：與對照組相比較，**P < 0.01。圖2 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3對SKOV3細胞增殖能力的影響(n=3)Note. Compared with the NC group，**P < 0.01.Fig.2 The effect on SKOV3 cell proliferation after transfection siRNA IGFBP2, siRNA IGFBP3

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后分別在24 h檢測了細胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在24 h時轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3組的細胞凋亡百分比與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01，P< 0.001)。(見圖3)

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞遷移能力的影響

為觀察IGFBP-2、IGFBP-3對SKOV3細胞遷移能力的影響，SKOV3細胞轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后分別在0 h、24 h檢測了細胞遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染0 h時，3組無明顯差別，轉(zhuǎn)染24 h后，與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3明顯降低了SKOV3細胞的遷移能力，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01，P< 0.001)。(見圖4)

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞侵襲能力的影響為觀察IGFBP-2、IGFBP-3對SKOV3細胞侵襲能力的影響，SKOV3細胞轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后在24 h檢測了細胞侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h后，與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3明顯降低了SKOV3細胞的侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。(見圖5)

2.6 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞順鉑耐藥性的影響為觀察IGFBP-2、IGFBP-3對SKOV3細胞耐藥性的影響，SKOV3細胞轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后加入不同濃度的順鉑(5、10、20 μg/mL)，在24 h后檢測了細胞存活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3明顯降低了SKOV3細胞的耐藥性，加入順鉑濃度為5 μg/mL、10μg/mL時細胞存活數(shù)量減少，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，加入順鉑濃度為20 μg/mL時細胞存活數(shù)量明顯減少，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。(見圖6)

注：與對照組相比較，**P < 0.01，***P < 0.001。圖4 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞遷移能力的影響(n=3)Note. Compared with the NC group，**P < 0.01，***P < 0.001.Fig.4 The effect on migration of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP -2, siRNA IGFBP-3

注：與對照組相比較，**P < 0.01。圖5 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞侵襲能力的影響(n=3)Note. Compared with the NC group，**P < 0.01.Fig.5 The effect on invasion of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP -2, siRNA IGFBP-3

注：與對照組相比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖6 轉(zhuǎn)染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3對SKOV3細胞順鉑耐藥性的影響(n=3)Note. Compared with the NC group，*P < 0.05，**P < 0.01.Fig.6 The effect on drug resistance of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP -2, siRNA IGFBP-3

3 討論

卵巢癌主要的治療方法為手術(shù)治療、放化療等，但治療后3～5年的復發(fā)率為70%左右，復發(fā)后患者的治療效果極差，并且對多種化療藥物出現(xiàn)耐藥性[4]，因此，分子靶向治療將是卵巢癌治療的重要方向。在大多數(shù)的惡性腫瘤中均有基因突變現(xiàn)象，針對突變基因進行精準治療，對患者的治療效果及化療藥的耐藥性會有明顯改善。

IGFBP2，IGFBP3是胰島素樣生長因子家族的重要成員，在人的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用[5,6]。目前發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、前列腺癌及卵巢癌等患者體內(nèi)出現(xiàn)異常高表達[7-9]。有研究認為IGFBP2高表達可促進腫瘤細胞的增殖，而IGFBP3的高表達可抑制腫瘤的增殖與遷移[10]，并且IGFBP2，IGFBP3的表達與腫瘤分期及預后密切相關(guān)[11]。本研究通過干擾卵巢癌細胞中IGFBP2，IGFBP3的表達，觀察對卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、耐藥的影響。有研究表明，IGFBP-2 在卵巢癌中發(fā)揮重要的生物學作用是通過在卵巢惡性腫瘤組織、患者血清和囊液中過表達[12,13]。Lee EJ等[14]通過侵襲實驗已經(jīng)證明了IGFBP-2 能刺激SKOV3 細胞侵襲，通過siRNA 來抑制它的表達而刺激作用減弱。Torng PL等[15]的研究表明IGFBP-3在人卵巢子宮內(nèi)膜樣癌OVRW59-P4細胞系中能抑制細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究中干擾IGFBP2，IGFBP3在卵巢癌中的表達后發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞增殖受到明顯抑制，凋亡增加了10倍左右，遷移與侵襲也受到了不同程度的抑制作用。與 Lee EJ等人的研究結(jié)果一致，而與Torng PL等人的研究結(jié)果有一定的差異，這可能與IGFBP3在腫瘤細胞中的雙重作用有關(guān)。一方面，IGFBP3可以與IGF形成三元絡合物，抑制IGF的促有絲分裂作用，該過程是通過ALS進行的。另一方面，IGFBP3也可通過與IGF的結(jié)合有效地延長IGF的半衰期而提高IGF在組織的生物利用率，因為在絡合物中IGF的半衰期為15 h，而游離的IGF半衰期為20～30 min，所以IGFBP3是IGF的循環(huán)庫。IGFBP3的這兩種作用受許多因素調(diào)節(jié)，所以這可能是造成IGFBP3在腫瘤中作用不一致的原因之一。IGFBP3不僅可以通過IGF發(fā)揮作用，有報道IGFBP3也可以通過其他途徑發(fā)揮作用，但具體機制還需進一步研究。因此，IGFBP通過與IGFR競爭性的與IGF結(jié)合,以IGF依賴性和非依賴性等方式發(fā)揮作用,在惡性腫瘤的侵襲、遷移發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。IGFBP2有促進腫瘤細胞遷移、侵襲作用是因為IGFBP2能使基質(zhì)金屬蛋酶表達增加，而基質(zhì)金屬蛋白酶的作用是降解細胞外基質(zhì),從而促進了腫瘤細胞向周圍正常組織的遷移與侵襲。

順鉑是一種常用的化療藥，其治療惡性腫瘤效果顯著，但是副作用較多，并且有些腫瘤已經(jīng)對順鉑產(chǎn)生了耐藥性，有研究表明腫瘤的發(fā)生以及對藥物的耐受與腫瘤的凋亡抑制密切相關(guān)[16]。有研究表明多數(shù)卵巢癌細胞系及所有卵巢上皮性癌組織均表達IGF-1R[17-18]。并且IGF-1R可促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關(guān)，IGF-1受體的高表達與化療耐藥及不良預后相關(guān)[19]。本研究中通過干擾IGFBP2，IGFBP3，觀察其對卵巢癌耐藥性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾IGFBP2，IGFBP3后，卵巢癌細胞SKOV3對順鉑的敏感性明顯增強。因此，卵巢癌細胞的耐藥性可能與IGFBP2、IGFBP3的異常表達有關(guān)。

在正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化的過程中,胰島素樣生長因子家族各組成分存在著性質(zhì)和數(shù)量的變化表明胰島素樣生長因子家族在正常細胞增生和惡性轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用。而在胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族中，IGFBP3 含量最高，其次為 IGFBP2。因此，通過研究 IGFBP2，IGFBP3在卵巢腫瘤組織中的表達與腫瘤侵襲、遷移的相關(guān)性，從而探討 IGFBP2，IGFBP3在卵巢癌發(fā)病及發(fā)展、耐藥可能的作用機制，進而為卵巢癌的預防、早期診斷及治療提供理論依據(jù)。

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Effects of IGFBP2 and IGFBP3 expression in ovarian tumors on migration, invasion of ovarian cancer

LI Jun,LIU En-ling*,YANG Li

(Obstetrics Department,Tangshan City workers′ Hospital, Tangshan 063000,China)

Objective To study the effect on ovarian tumor migration invasion after inhibition the expression of IGFBP2, IGFBP3.Methods siRAN interference IGFBP2, IGFBP3 expression in ovarian cancer cell lines SKOV3, SKOV3 proliferation detected by CCK-8 kits,SKOV3 apoptosis detected by flow cytometry,SKOV3 migration and invasion detected by transwell experiment and scratched cell healing detection; CCK-8 method detected survival after treated different concentrations of cisplatin (5, 10, 15, 20 ug/mL). Results The proliferation ability of SKOV3 dropped and apoptosis increased after treated siRAN IGFBP2, IGFBP3 compared with the control group , migration and invasion function decline, resistance level to improve greatly. Conclusions The expression of IGFBP2, IGFBP3 in ovarian cancer affected migration and invasion.

IGFBP-2;IGFBP-3;Ovarian;Cancer

2014年河北省醫(yī)學科學研究重點課題(ZD20140384)。

李君(1980-)，女，碩士研究生，研究方向：產(chǎn)科基礎(chǔ)及臨床方面研究。E-mail: lijun135579@sina.com

劉恩令(1966-)，男， 博士，主任醫(yī)師， 研究方向：卵巢癌耐藥的研究。E-mail: enling111@sina.com

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0032-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.007

2016-06-30