黃 雪 鄭媛媛 李富榮

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，深圳518000)

免疫細胞靶向治療結(jié)腸癌腫瘤干細胞①

黃 雪 鄭媛媛 李富榮

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，深圳518000)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)發(fā)病率列我國第三位。隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食習(xí)慣的改變,發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，結(jié)直腸癌5年生存率只有50%[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌腫瘤干細胞在結(jié)直腸癌的發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。結(jié)直腸癌腫瘤干細胞(Colorectal cancer stem cells，CCSCs)是結(jié)直腸癌腫瘤組織中數(shù)量很少的一部分細胞，但是這類細胞具有很強的致瘤性和化療抵抗性，是結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的源頭。研究發(fā)現(xiàn)這類細胞能進行自我更新和分化成新的腫瘤，在放化療后能進入休眠狀態(tài)，當微環(huán)境發(fā)生改變時，開始增殖并轉(zhuǎn)移到其他地方形成轉(zhuǎn)移灶[3]。免疫細胞治療作為新的治療技術(shù)，通過免疫細胞靶向治療結(jié)直腸癌腫瘤干細胞可能是從根本上根治結(jié)直腸癌的手段。本文就近年來結(jié)直腸癌腫瘤干細胞分離、純化、表面標記，以及各種針對腫瘤干細胞免疫細胞治療的研究進展作一綜述。

1 結(jié)直腸癌腫瘤干細胞生物學(xué)特性

結(jié)直腸癌的干細胞具有自我更新能力，具有類似的分化能力和類似的信號通路，多處于靜息期，具有自分泌能力以及耐藥性等[4]。腫瘤干細胞具有與正常干細胞相似的自我更新的特征，不同的是正常干細胞的自我更新是在基因調(diào)控下進行的有序的增殖與分化，而腫瘤干細胞的增殖是無限和無序的，且不能分化為成熟細胞[5]。腫瘤干細胞分化出的細胞具有異質(zhì)性，不同類型的亞克隆伴隨著不同屬性的產(chǎn)生，只有部分克隆細胞可以轉(zhuǎn)移形成轉(zhuǎn)移性腫瘤。這些轉(zhuǎn)移的克隆細胞可以進一步地累積突變基因，形成與原始病灶不同的轉(zhuǎn)移性腫瘤[4，6]。根據(jù)種子土壤學(xué)說，腫瘤起始細胞作為種子，能生產(chǎn)自己的土壤，增加了起始細胞在腫瘤微環(huán)境中懸浮單細胞的生存能力[7]。由于腫瘤干細胞的強大的致瘤能力，猜想這可能和上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變(EMT)密切相關(guān)。Radisky等[8]人發(fā)現(xiàn)CCSCs可以通過侵犯血管，經(jīng)過上皮間葉組織轉(zhuǎn)分化作用到達遠處的組織，形成新的腫瘤，由于結(jié)腸癌腫瘤干細胞的這些特性，可以選擇以結(jié)腸癌腫瘤干細胞作為治療靶標，除了傳統(tǒng)的方法來治療結(jié)直腸癌以外，通過免疫細胞清除腫瘤干細胞具有預(yù)防結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移作用。

2 結(jié)直腸癌腫瘤干細胞表面標記物

免疫染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌腫瘤干細胞的表面抗原標記物，主要有CD44、CD24、CD166、CD133、CD29和ALDH1?？梢酝ㄟ^流式細胞儀等方法成功分離出結(jié)直腸癌腫瘤干細胞，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中每100 個細胞中至少就會有一個 CD44+CSC具有致瘤性[2,3]，取結(jié)直腸癌組織中一個 CD44 陽性細胞，在體外可以培養(yǎng)成類似原發(fā)癌的腫瘤組織。曾有研究者用流式細胞儀觀察到組織外周血中 CD3+細胞 CD24 熒光強度，發(fā)現(xiàn)其表達量與結(jié)直腸癌有關(guān)。在結(jié)直腸癌動物模型體內(nèi)注入隱匿 HT29 或 Colo357 細胞的 siRNA，7～10 d內(nèi)可形成肉眼可見的腫瘤;在標準的化療方案中加入抗 CD24 抗體，則發(fā)現(xiàn)腫瘤生長得到抑制[7]。有人證實腫瘤細胞表面 CD166 表達與病理分級及侵襲深度有關(guān)，與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 Dukes 分期無關(guān)[8]。把培養(yǎng)的原發(fā)和肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸細胞“癌球”植入 NOD/SCID 小鼠可見其導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，約每 16 個 CD133+細胞中有一個可以成癌球，顯示CD133+可能是CCSCs表面標志物[9]。研究者把500 個 ALDH1+ESA+細胞置入 NOD/SCID小鼠，30 d 內(nèi)就能形成腫瘤，而10 000 個 ALDH1-ESA+細胞在 50 d 內(nèi)仍無法致瘤[10]，研究統(tǒng)計 ALDH1 表達與結(jié)腸癌患者年齡、性別、分化程度、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及 Duke′s 分期無關(guān)，但與預(yù)后有關(guān)，表達越低預(yù)后越好。另外,EpCAM、CD44、CD166和 DAB2IP 表面標記物也是結(jié)直腸癌腫瘤干細胞表面標志特征，如 DAB2IP與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，DAB2IP會抑制NF-κB介導(dǎo)的上皮間質(zhì)間的轉(zhuǎn)分化作用，在結(jié)腸癌中DAB2IP低表達的患者往往預(yù)后較差且生存時間更短。目標研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌腫瘤干細胞表面標志物，見表1。

3 免疫細胞靶向治療結(jié)直腸癌腫瘤干細胞

由于腫瘤干細胞大多處于休眠狀態(tài),具有較強的耐藥性及放療不敏感性，傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物和放療不能對其有效殺滅，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。細胞免疫干預(yù)作為一種有效的治療手段，它可以靶向腫瘤特異性抗原(TSAs)和/或腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)，可特異性清除腫瘤細胞或腫瘤干細胞。CSCs由于具有對常規(guī)治療抵抗性，這些腫瘤起始細胞除表達干細胞抗原外，可能還包含許多編碼腫瘤特異性抗原的突變。因此，制備抗結(jié)直腸癌腫瘤干細胞的疫苗，以及針對結(jié)直腸癌腫瘤干細胞表面抗原的特異性靶向免疫細胞，可清除手術(shù)后或化療后殘存結(jié)腸癌腫瘤干細胞，將解決腫瘤干細胞藥物抵抗和復(fù)發(fā)問題，以大大提高結(jié)直腸癌治愈率[20,21]。

3.1 DC疫苗 目前為止，DCs被認為是功能最強大的抗原提呈細胞，能激活T細胞，產(chǎn)生強大的免疫應(yīng)答[22]， Zarnani等[23]在結(jié)腸癌小鼠模型中，給在結(jié)腸癌腫瘤細胞上面負載了一個腫瘤細胞特異性的抗原肽gp70-derived peptide(AH1)和一個輔助蛋白分子卵清蛋白(OVA)，得到DC-Pep-OVA 這樣的DC疫苗，再注射到結(jié)腸癌小鼠體內(nèi)，表現(xiàn)出更長的存活時間。2010年FDA批準上市的Provenge(sipuleucel-T)，用于治療轉(zhuǎn)移性激素抵抗性前列腺癌(CRPC)，Provenge誘導(dǎo)作用是通過抗原提呈細胞(APCs)負載前列腺癌酸性磷酸酶(PAP)抗原，與GM-CSF的因子進行了融合，而GM-CSF的作用就是促進樹突狀細胞的擴增與分化成熟，可使腫瘤抗原在樹突狀細胞表面有效地表達，繼而激活腫瘤特異的CD8+T細胞，誘導(dǎo)抗前列腺癌免疫應(yīng)答，目前sipuleucel-T已經(jīng)通過了臨床實驗[24]。研究比較熱的還有全細胞抗原負載的 DCs 疫苗，將腫瘤細胞的裂解物來致敏DCs，Alteber等[25]通過冷凍消融術(shù)后再來負載DCs，并觀察冷凍消融術(shù)負載DCs和對照組的生存時間，觀察到72 d時，負載疫苗的小鼠能夠存活而且通過體內(nèi)的光化學(xué)檢測沒有發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移。也有通過基因修飾的方法來致敏DCs的，將腫瘤細胞的特異性抗原直接加載到DCs上，使DCs更能有效地與MHC分子進行結(jié)合，產(chǎn)生更加強大且持久的免疫應(yīng)答，Benteyn等[26]人將m-RNA修飾在DCs上，獲得比對照組更有效的免疫應(yīng)答，抗結(jié)直腸癌干細胞的DC疫苗激活自體T細胞后會引起結(jié)直腸CSC抗原特異性的T細胞應(yīng)答。有學(xué)者利用自體DC負載后的腫瘤裂解物對結(jié)直腸癌患者進行皮下注射，發(fā)現(xiàn)其活化T細胞對腫瘤細胞有強大的殺傷作用，而且并未發(fā)生明顯不良反應(yīng)，說明了DC用作疫苗的高效安全性[22]，2015年杜克大學(xué)開發(fā)了一種新的方法，用破傷風(fēng)毒素來刺激免疫系統(tǒng)增強了DCs疫苗對惡性腦膠質(zhì)瘤的效力，研究表明巨細胞病毒(CMV)存在于膠質(zhì)瘤細胞中，但目前還不清楚這種病毒是否導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)發(fā)展，這種DC疫苗主要針對巨細胞病毒的，在接受破傷風(fēng)加強劑治療的患者生存值超過了36.6個月，而僅接受樹突狀細胞注射治療的患者平均生存時間僅為18.5個月[27]。這個結(jié)果是非常令人振奮的。

表1 結(jié)直腸癌腫瘤干細胞表面標記物

Tab.1 Specific molecular biomarkers of CCSC

標記物別名功能參考文獻ALDH1ALDH1A1，RALDH1在細胞內(nèi)催化乙醛氧化成乙酸[11]CD133Prominin?1，AC133連接兩個膽固醇酯，包含了兩個血漿質(zhì)膜微小結(jié)構(gòu)域的跨膜糖蛋白[12]CD44PGP?1，HUTCH?1，GP90，EPICAN，CDW44，MIC4一種細胞黏附分子，參與淋巴細胞的激活和淋巴循環(huán)[13]EpCAM，TACSTD1，CD326，17?A，ESA，EGP40上皮細胞黏附分子[14]CD24HSA黏蛋白樣的細胞黏附分子[15]CD29B1Integrin受體細胞外基質(zhì)蛋白，參與調(diào)控細胞遷移、增殖、生存、分化和死亡[16]Lgr5GPR49R?spondin受體蛋白，成體干細胞的表面標記物[17]CD166ALCAM白細胞活化黏附因子[18]BMI?1干細胞自我更新的調(diào)節(jié)器，核心蛋白復(fù)合體(PRC1)的組成部分[19]

3.2 CTL細胞 細胞毒性T淋巴細胞(CTL)能識別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigen，TAA)，抗原肽由HLA-Ⅰ類分子提呈，提呈給CD8+T 細胞，CD8+T 細胞具有很強大的抗腫瘤細胞效應(yīng)，而激活CTLs的重要的分子就是HLA-Ⅰ，有報道稱惡性腫瘤就是由于失去了表達HLA-Ⅰ類分子使得不能有效地將腫瘤的表面抗原提呈給CTLs，無法引起有效的免疫應(yīng)答，使機體無法及時的清除腫瘤細胞[28]，Sokol等[29]實驗發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中由于MHCⅠ分子表面TPA結(jié)合蛋白(Tapasin)的缺失，以致CD8+CTL不能有效地對腫瘤細胞進行攻擊，并且與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和惡性發(fā)展有極大關(guān)系。Morita等[30]科學(xué)家通過使用siRNA來對嗅覺受體7C1(OR7C1)過表達和基因敲除，發(fā)現(xiàn)OR7C1可以作為新的篩選結(jié)腸癌腫瘤干細胞的標志，而CTL能特異性的識別結(jié)腸癌腫瘤干細胞。Visus 等[31]，已經(jīng)證明ALDH高表達的細胞能誘導(dǎo)CD8+T 細胞免疫應(yīng)答，通過流式細胞儀分選出ALDH高表達的細胞來致敏CD8+T 細胞，將致敏后的CD8+T 細胞和從健康人中分離出的HLA-A2-restricted樹突狀細胞一起共培養(yǎng)，過繼給腫瘤小鼠進行細胞免疫治療，結(jié)果小鼠體內(nèi)的腫瘤生長受到了抑制，而且表現(xiàn)出更長的存活時間，這個實驗說明ALDH高表達的細胞可能是CTL潛在的作用靶點。Kryczek教授[32]及其團隊發(fā)現(xiàn)IL-22+CD4+的T細胞能通過激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3和誘導(dǎo)甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L促進結(jié)腸癌細胞的干性，當用結(jié)腸腺癌細胞系DLD-1給NSG小鼠種植腫瘤時發(fā)現(xiàn)，105個DLD-1細胞不能在NSG小鼠體內(nèi)形成腫瘤，而用外源性的IL-22作用，小鼠腫瘤的體積明顯增大。在結(jié)腸癌中，CD8+T細胞是抗腫瘤免疫的重要細胞，Th1型趨化因子CXCL9 和CXCL10能對免疫細胞Th1和CD8+T細胞起調(diào)節(jié)作用。Nagarsheth等[33]通過用IFN-γ來刺激結(jié)腸癌的單細胞懸液，發(fā)現(xiàn)CXCL9和 CXCL10的水平有所升高，觀察到CD8+T細胞浸潤結(jié)腸癌腫瘤的程度也更深。Wei[34]報道結(jié)直腸癌腫瘤干細胞能表達共刺激抑制信號 CD274 (B7-H1)和可溶性LGALS3 (galectin-3)，能削弱CTLs和γδT細胞的作用，抑制腫瘤的免疫應(yīng)答。Morita等[30]報道OR7C1 作為一個新的結(jié)直腸癌腫瘤干細胞表面抗原篩選標志，以O(shè)R7C1 來源的抗原肽致敏的CTLs，對結(jié)腸癌腫瘤干細胞有很強的殺傷毒性。OR7C1致敏的CTL抗腫瘤效應(yīng)比CTL細胞毒性T淋巴細胞克隆有更強的抗腫瘤性，有研究者觀察到結(jié)腸癌腫瘤干細胞能表達一種膜融合蛋白和分泌可溶性的IL-4，而這些信號會抑制T細胞對腫瘤干細胞的免疫反應(yīng)，且IL-4的水平在體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有很密切的聯(lián)系[35]。結(jié)直腸癌腫瘤干細胞致敏的CTL細胞免疫治療有可能成為治療結(jié)直腸癌的一個希望。

3.3 NK細胞 自然殺傷細胞(NK)是機體重要的免疫細胞，能識別病毒感染細胞和腫瘤細胞，主要是由于NK細胞能調(diào)節(jié)腫瘤細胞上面的MHCⅠ和MHCⅡ類分子，NK細胞能識別非特異性的抗原，不需要特異性的HLA表達。NK細胞在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用。CD133已經(jīng)證明存在于腫瘤干細胞表面，也包括結(jié)腸癌腫瘤干細胞。有學(xué)者已經(jīng)證明NK細胞能高度識別腫瘤干細胞，表明NK細胞能有效靶向殺傷腫瘤干細胞和非干性的腫瘤細胞的可能。最近研究發(fā)現(xiàn)NK細胞對于CD133陽性的細胞具有很強的殺傷作用[36]。Kim[37]通過比較原位結(jié)腸癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的腫瘤干細胞發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細胞系(KM12L4A 和KM12SM)中腫瘤干細胞表面NKG2D 配體和DR4/5水平是明顯高于原位結(jié)腸癌的，NK92細胞對KM12L4A 和KM12SM的殺傷作用也更加敏感。結(jié)腸癌腫瘤干細胞表面低表達CD1d，有實驗發(fā)現(xiàn)加入胸腺肽α1能上調(diào)CD1d的表達，CD1d能有效刺激NK細胞的免疫應(yīng)答，抑制Erk/MAPK途徑，致敏NK細胞，實驗中24 h內(nèi)，血液中NK細胞的數(shù)量已經(jīng)達到一個高水平，體內(nèi)、體外實驗都得到驗證[38]。Tallerico等[39]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌干細胞表面的MHCⅠ類分子相對于結(jié)腸癌細胞是低表達的，而 MHCⅠ類分子，會減弱NK細胞的免疫應(yīng)答作用，研究人員用純化同種異體的NK細胞來識別和殺傷結(jié)直腸癌腫瘤肝細胞，這是由于結(jié)直腸癌腫瘤干細胞白表面可高表達NKp30和NKp44配體。Ueda等[40]科學(xué)家在小鼠結(jié)腸癌中對小鼠進行自體干細胞移植，再對脾臟中的NK細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)在1到3周后NK細胞在結(jié)腸癌小鼠自體干細胞移植組比未進行自體干細胞移植組的細胞數(shù)量增加，并且是高度激活的。而且在2周時，NK細胞的數(shù)量和活性達到一個頂峰狀態(tài)，但這是在小鼠實驗階段的結(jié)果，進入臨床還有待研究。

3.4 TCR-T及CAR-T TCR-T是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾的T細胞，基因轉(zhuǎn)染TCRs與靶細胞特異性的MHC分子結(jié)合，既能識別細胞表面抗原，又能識別細胞內(nèi)抗原[41]。早在2006年Morgan等[42]就報道采用基因修飾的方法來治療轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤，將特異性的TCR-T細胞與黑色素瘤的MART-1基因特異性的結(jié)合，實驗的17個患者中有2名患者腫瘤縮小且生存時間延長。后來用高活性的TCR修飾后的T細胞能識別滑膜肉瘤的NY-ESO-1抗原，6個試驗患者中，4個患者引起了強烈的免疫應(yīng)答。Rapoport等[43]于2015年對20例多發(fā)性骨髓瘤的患者進行臨床試驗，用TCR-T治療后其中14名患者接近完全緩解(near complete response，nCR)，2名患者獲得較大緩解(Very good partial response，VGPR)，一名患者表現(xiàn)為病情穩(wěn)定，另一名表現(xiàn)出有進展，但是所有患者均超過100 d表現(xiàn)出接近完全緩解或較大緩解，平均存活時間達到了19.1個月。而CAR載體通常來源于抗原蛋白的一部分，表達在T細胞表面時，能與靶細胞結(jié)合，激活CAR-T細胞。最近CAR-T已經(jīng)發(fā)展到第三代，包含了雙刺激分子，如CD28+CD134 (OX40) 和CD28+CD137 (4-1BB)[44]。雖現(xiàn)在對于結(jié)直腸癌腫瘤干細胞的免疫治療上，CAR-T及TCR的文獻報道還比較少，但是運用CAR-T及TCR與結(jié)直腸癌腫瘤干細胞特異性抗原結(jié)合，也為結(jié)直腸癌腫瘤干細胞的免疫治療提供了一個新的思路。

3.5 其他 最近有研究者用白喉桿菌與胃泌素-17進行共軛，而胃泌素-17作為生長因子本身能促進胃腸道腫瘤的生長，在這項臨床研究中，有三分之一的患者獲得了部分免疫應(yīng)答，32%的患者病情更加穩(wěn)定，其余的患者產(chǎn)生了抗胃泌素-17的抗體，生存時間明顯延長[45]。有研究團隊將人5型腺病毒作為疫苗，發(fā)現(xiàn)能在67%的轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌患者中引起較強的免疫反應(yīng)，但是這項研究并沒有明顯提高患者的生存期[46]。

4 展望

研究已經(jīng)證明腫瘤干細胞比一般的腫瘤細胞的免疫原性更低，而且腫瘤干細胞會下調(diào)自身的某些抗原的表達來逃脫免疫細胞的免疫效應(yīng)作用。因此，識別和增加腫瘤干細胞表面的特異性抗原來增加免疫應(yīng)答作用是非常有必要的。隨著對結(jié)腸癌腫瘤干細胞的認識更加深入，以及對結(jié)腸癌腫瘤干細胞表面抗原標記物的發(fā)現(xiàn)，以及新的免疫細胞制備的技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)和改進，將為人類預(yù)防或治愈結(jié)腸癌提供了可能。

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[收稿2016-06-02 修回2016-08-02]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.034

黃 雪(1992年-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫治療方面研究，E-mail：654954659@qq.com。

及指導(dǎo)教師：李富榮(1963年-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事細胞治療方面的研究，E-mail:frli62@163.com。

R392

A

1000-484X(2017)01-0156-05

①本文為深圳市科技計劃項目(No.201402014)。