郭禮強, 張金玲, 李凱, 丁葵英, 吳翠玲

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041；2. 安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

HPLC-MS/MS法測定飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量

郭禮強1, 張金玲1, 李凱1, 丁葵英1, 吳翠玲2

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041；2. 安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

建立了高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)快速測定飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑的含量。飼料樣品用乙酸乙酯提取后，經PCX固相萃取柱凈化處理，過0.22 μm濾膜，以乙腈和含0.1%的甲酸水溶液為流動相，經Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)分離，多級反應監(jiān)測(MRM)正離子模式下掃描分析。結果表明，甲硝唑和二甲硝咪唑在0.2～50 μg/L范圍呈良好線性，線性相關系數均大于0.997，檢出限均為0.2 μg/kg，定量下限均為0.5 μg/kg。樣品在定量下限1倍、2倍、10倍3個加標水平下的平均回收率為95.3%～103.2%，相對標準偏差(RSD)為4.67%～8.46%。該方法靈敏、簡便、準確，可用于飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑的檢測分析。

飼料；含量分析；甲硝唑；二甲硝咪唑；液相色譜-串聯質譜

硝基咪唑類藥物(nitromidazoles)是一類廣泛應用的人工合成的具有5-硝基咪唑基本結構的抗菌、抗原蟲藥物，甲硝唑(metronidazole)和二甲硝咪唑(dimetridazole)為硝基咪唑類藥物的兩種，對原蟲及各種厭氧細菌具有顯著抑制作用，也用作生長促進劑，以促進牛、豬、禽的生長及改善飼料轉化率。然而，甲硝唑和二甲硝咪唑對人體有多種毒副作用，尤其是具有致突變和致癌性。歐盟在96/23/EC歐盟理事會指令及EC2377/90[1]中將其列入A類禁用藥，日本也將二甲硝咪唑列入肯定列表制度，屬于15種農業(yè)化學品中的一種，不得在任何食品中檢出。為防止二甲硝咪唑等致癌藥物在食源性動物殘留對人體健康產生危害，我國也于2002年禁用了該類藥物[2]。甲硝唑和二甲硝咪唑的檢測方法有氣相色譜法[3-4]、氣相色譜-質譜法[5-6]、液相色譜法[7-11]以及液相色譜-串聯質譜法[12-17]，氣相色譜和氣相色譜-質譜法的缺點是需要衍生化，液相色譜法的選擇性和靈敏度較差，具有高特異性和靈敏度的液相色譜-質譜法是目前檢測硝基咪唑類藥物含量的首選方法。由于監(jiān)管的滯后和經濟利益的驅使，硝基咪唑類藥物經常被用于動物飼料和動物疫病防治過程，因此建立飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量的分析方法，增加了檢驗檢疫行政執(zhí)法的手段。飼料成分復雜，尤其是預混料，粉塵顆粒較多，若凈化效果不好將嚴重影響結果的判斷，本文應用液相色譜-串聯質譜法同時檢測飼料中的甲硝唑和二甲硝咪唑藥物，該方法具有快速高效、高通量、高靈敏度等特點，為從源頭上對動物飼料的監(jiān)控提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀：Agilent 1260-6460(美國Agilent公司)，配電噴霧離子源(ESI)；離心機：5810R型(Eppendorf公司)；氮吹儀：N-EVAP(Organomation Associates公司)；純水機：Milli-Q(美國Millipore公司)；萬分之一天平(Mettler AE163)；振蕩器(IKA MS1)；5 mL一次性注射器；0.22 μm針頭過濾器；混合型陽離子交換柱：60 mg/3 mL(Agela公司)。

甲硝唑、二甲硝咪唑和氘代二甲硝咪唑標準品均購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均為色譜純，美國Biopure公司； 鹽酸和氨水為分析純，天津科密歐公司。

標準溶液：分別配制甲硝唑、二甲硝咪唑和氘代二甲硝咪唑終濃度濃度均為100 ng/mL的標準溶液，于0～4 ℃冰箱中保存。定容液：取80 mL 0.1% 的甲酸水(V/V)，與20 mL乙腈混勻。

1.2 樣品處理 稱取5.0 g(預混合飼料2.0 g)樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入內標工作溶液100 μL(預混合飼料加40 μL)，加入15 mL乙酸乙酯均質提取1 min，10000 r/min離心10 min，將上清液轉入50 mL聚丙烯離心管，殘渣再次用15 mL乙酸乙酯渦混重復提取，合并提取液，氮氣吹干，用0.1 mol/L鹽酸25 mL溶解，濾紙過濾。依次用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸活化陽離子交換柱，將上述溶解液全部過柱，依次用5 mL 0.1 mol/L鹽酸，5 mL甲醇淋洗， 6 mL洗脫溶液洗脫并收集，在40 ℃水浴上氮氣吹干，用 1 mL 初始流動相溶液渦旋溶解，過0.22 μm濾膜，供質譜測定。

1.3 液相色譜串聯質譜條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相A：甲酸水(1:999,V/V)溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0 min 20%流動相B；3.0 min 40%流動相B；4.0 min 90%流動相B；4.1 min 20%流動相B；6.0 min 20%流動相B。進樣體積20 μL。柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min。

1.3.2 質譜條件 大氣壓電噴霧電離源(ESI)，正離子電離模式；干燥氣：10 L/min ；干燥溫度：350 ℃；噴霧氣：45 psi ；電子倍增器電壓：400 V；毛細管電壓：4000 V；霧化氣壓力：275.8 kPa(40 psi)；多反應監(jiān)測模式(MRM)；甲硝唑和二甲硝咪唑的部分質譜參數見表1。

表1 甲硝唑和二甲硝咪唑的部分質譜參數

*定量離子

2 結果與分析

2.1 線性關系、檢出限與定量下限 對兩種目標分析物質量濃度在0.20～50 μg/L之間的系列混合標準溶液進行測定，以各化合物定量離子與內標校正離子峰面積之比的平均值(Y)對其質量濃度 (X，μg/L)繪制標準曲線，其相關系數(r)均大于0.997。在飼料中添加系列濃度的混合標準物質，以信噪比(S/N)為3作為方法的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10作為方法的定量下限(LOQ)，甲硝唑和二甲硝咪唑的LOD為0.20 μg/kg，LOQ分別為0.50 μg/kg。兩種目標分析物的提取離子流圖見圖1，回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量下限見表2。

圖1 混合標準溶液(0.5 μg/L)中甲硝唑和二甲硝咪唑的多反應監(jiān)測色譜圖

化合物回歸方程相關系數(r)線性范圍/(μg·L-1)檢出限/(μg·kg-1)定量下限/(μg·kg-1)甲硝唑Y=0．335365X+0．1371720．99790．20～50．00．200．50二甲硝咪唑Y=0．486102X-0．48450．99830．20～50．00．200．50

2.2 準確度與精密度 在牛預混料空白樣品中添加甲硝唑和二甲硝咪唑定量下限1倍、2倍、10倍3個水平的混合標準物質進行加標回收實驗。以回收率結果表示方法準確度，回收率的相對標準偏差(RSD)表示方法的精密度，每個水平平行測定6個樣品，測定結果見表3。結果顯示，甲硝唑和二甲硝咪唑在3個加標水平下的平均回收率分別為95.3%～103.2%，相對標準偏差(RSD)分別為4.67%～8.46%。

表3 檢測方法的添加精密度和平均回收率(n=6)

2.3 實際樣品的測定 對市場上購買的20份飼料中的甲硝唑和二甲硝咪唑進行測定，在1份雞預混飼料樣品中檢出了二甲硝咪唑(3.1 μg/kg)，說明仍存在企業(yè)違法添加禁用硝基咪唑類抗菌藥物。

3 討論與小結

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化 飼料基質復雜，不同的提取溶劑對回收率的影響很大。本文考察了甲醇[10,17]、乙腈[12,14]、乙酸乙酯[4,15,18]作為提取劑對甲硝唑和二甲硝咪唑回收率的影響，試驗發(fā)現采用甲醇、乙醇、乙腈作為提取劑用于飼料樣品的提取，會產生非常多的干擾雜質，即使采用陽離子固相萃取柱凈化也非常困難，抑制了目標分析物的靈敏度和回收率，而使用乙酸乙酯作為提取溶劑，可以顯著降低飼料中的基質干擾。試驗進一步比較了飼料加水浸潤后添加標準品經乙酸乙酯提取和飼料直接添加標準品后經乙酸乙酯提取對回收率的影響，結果發(fā)現，飼料經水浸泡后經乙酸乙酯提取，提取回收率反而降低，說明飼料浸潤提取的雜質更多，不利于目標分析物的檢測。試驗同時考察了酸性乙酸乙酯溶液對目標物回收率的影響，在飼料基質中添加15 mL乙酸乙酯后，再加入0.1 mol/L 鹽酸1 mL，結果發(fā)現回收率非常低，分析后認為在震蕩提取的過程中鹽酸和目標分析物結合，造成大部分目標物保留在水相中。飼料浸潤和提取酸化反而抑制了目標分析物的回收率，最終確定只用乙酸乙酯作為提取溶劑。

3.2 樣品凈化條件的優(yōu)化 乙酸乙酯提取液中依然含有一定量極性的雜質，如蛋白質、脂肪和色素等脂溶性物質，尤其是牛預混料，提取液顏色為棕紅色，對甲硝唑和二甲硝咪唑有一定的干擾。為提高方法的靈敏度和通用性，采用固相萃取進一步凈化樣品。考察了MCX、PCX、WCX三種凈化柱對目標物回收率和穩(wěn)定性的影響，發(fā)現MCX和PCX凈化柱回收率分別為85.2%和84.1%，要好于WCX凈化柱，因MCX和PCX凈化柱回收率差異不明顯，從性價比考慮最終選用PCX凈化柱。乙酸乙酯屬于中等極性化合物，若直接將乙酸乙酯提取液過PCX凈化柱，降低了PCX凈化柱吸附目標物，影響回收率；凈化效果差，依然有一些色素殘留，干擾目標物分析。為提高方法的回收率和靈敏度，實驗進一步考察了甲酸、乙酸和鹽酸溶解目標物經PCX柱凈化對回收率的影響。提取液經氮氣吹干，分別用0.1 mol/L 的甲酸、乙酸和鹽酸溶解，經PCX柱凈化后經質譜檢測，試驗發(fā)現三種酸性溶液均能將目標物回收率提高到80%以上，但鹽酸質譜噪音低，靈敏度比甲酸和乙酸高20%以上，最終選用鹽酸溶液溶解。預混料粉塵多，乙酸乙酯殘渣用鹽酸溶液溶解后上柱，粉塵會堵塞固相萃取柱，過濾速度慢，通過試驗嘗試，上柱前先將溶解液濾紙過濾，能夠很好解決上柱慢的問題。

3.3 定量方法的選擇 研究發(fā)現，不同飼料樣品對甲硝唑和二甲硝咪唑的吸附有一定的差異，如雞預混料粉塵顆粒較多，對目標分析物吸附要比雞濃縮料和雞全價料高，造成提取回收率偏低，因此在定量方法選擇時采用內標法定量，可以有效的消除不同飼料基質帶來的干擾，本方法采用氘代二甲硝咪唑作為甲硝唑和二甲硝咪唑的內標，提高了定量方法的準確度。

3.4 色譜、質譜條件的優(yōu)化 分別配制500 μg/L的甲硝唑和二甲硝咪唑標準品，選用正離子模式掃描，優(yōu)化各化合物的毛細管電壓和碰撞能量，以響應值最高的兩個碎片離子和母離子組成定量離子對和定性離子對，并進行MRM參數的優(yōu)化。比較了甲醇和乙腈作為流動相對甲硝唑和二甲硝咪唑的影響，發(fā)現使用乙腈為流動相兩種目標物的MRM的提取離子流圖峰型較好，保留時間穩(wěn)定。

本文建立了飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑的高效液相色譜-串聯質譜聯用的檢測方法。該方法具有簡便、快速、靈敏、準確、實用性強等優(yōu)點，可以滿足復雜飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量的檢測要求。

[1] EEC2377/90關于確定動物源性食品中獸藥制品最高殘留限量程序的規(guī)定,國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 歐盟食品衛(wèi)生法規(guī)匯編[M]. 青島:中國海洋大學出版社, 2003：819.

[2] 農業(yè)部. 中華人民共和國農業(yè)部公告第193號[S].

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[18]GB/T 21995-2008. 中華人民共和國國家標準. 飼料中硝基咪唑類藥物的測定 液相色譜-串聯質譜法[S]．

(編輯：侯向輝)

Determination of Metronidazole and Dimetridazole in Feed by High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang1, ZHANG Jing-lin1, LI Kai1, DING Kui-ying1, WU Cui-ling2

(1.WeifangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Weifang，Shandong261041,China； 2.AgilenttechnologiesCo.,LtdinChina,Beijing100102,China)

A method for the determination of metronidazole and dimetridazole in feed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) is presented. The sample were purified with solid phase extraction column of PCX after extraction by ethyl acetate. After filtered with a 0.22 μm membrane, the sample was separated on a eclipse plus C18 column(3.0 mm × 100 mm, 1.8 μm)using gradient elution with mobile phases of acetonitrile and aqueous solution containing 0.1% formic acid, and detected on positive electrospray ionization with a multiple reaction monitoring (MRM) as survey scan. The results showed that the calibration curves were linear in the range of 0.2～50 μg/L for metronidazole and dimetridazole with correlation coefficient (r) more than 0.997. The LODs for metronidazole and dimetridazole was 0.2 μg/kg and the LOQs was 0.5 μg/kg. The average recoveries (n=6) in feed samples at three spiked levels(1 tismes, 2 times, 10 times) ranged from 95.3% to 103.2% with relative standard deviations (RSDs) of 4.67 - 8.46%. The method was sensitive, convenient and accurate, and could satisfy the demand of detection and analysis of metronidazole and dimetridazole in feed.

feed; content analysis; metronidazole；dimetridazole；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

濰坊市2015年科學技術發(fā)展計劃(2015ZJ1101)；山東出入境檢驗檢疫局科研基金項目(SK201349)

郭禮強，碩士，工程師，從事農獸藥殘留檢測研究。E-mail：glq1980@sina.com

2016-08-19

A

1002-1280 (2017) 01-0052-05

S859.83