何歡，張斌

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

牛腸道病毒的研究進(jìn)展

何歡，張斌*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

國(guó)內(nèi)近幾年牛腸道病毒病已經(jīng)開始逐漸流行，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多株新型病毒株并對(duì)此建立了多種分子及血清型方面的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)牛腸道病毒的基本結(jié)構(gòu)、鑒定方法、檢測(cè)方法、流行情況以及致病機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)的介紹，以期為更好的研究牛腸道病毒在我國(guó)的流行現(xiàn)狀及防治措施提供依據(jù)。

牛腸道病毒；分離鑒定；檢測(cè)方法；發(fā)病機(jī)制

牛腸道病毒(bovine enterovirus, BEV)廣泛存在于人類和各類動(dòng)物機(jī)體內(nèi)并且能夠引起其呼吸道系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的疾病，一般認(rèn)為BEV是牛腸道中原有的棲居者，在腸道中增殖，病原性不明顯。BEV的致病性有些許爭(zhēng)議，有認(rèn)為只引起輕度腹瀉或健康牛的隱性感染，也有認(rèn)為可引起呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病[1]，其致病性機(jī)理還不是很清楚。本文對(duì)牛腸道病毒的研究進(jìn)展作一綜述。

1 BEV的概述

1.1 形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能 牛腸道病毒為小RNA病毒科腸道病毒屬成員之一，為無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒，具有典型的二十面體立體對(duì)稱的球形結(jié)構(gòu)(圖1)。早期報(bào)道過(guò)BEV的晶體結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)牛腸道病毒衣殼蛋白的拓?fù)浜筒《玖Ｗ诱w結(jié)構(gòu)與小RNA病毒科其他成員一樣[3]。病毒粒子大小為25～30 nm，如圖1C所示為牛腸道病毒的電鏡圖片[4]，全長(zhǎng)7300～7500 bp，基因組中僅有一個(gè)開放閱讀框(ORF)，可直接作為mRNA 翻譯出一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)過(guò)一系列降解，產(chǎn)生4 種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3 和VP4)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D)，如圖1D所示為腸道病毒基因結(jié)構(gòu)的示意圖[5]。VP1、VP2、VP3與VP4蛋白包繞基因組RNA組成病毒的基本結(jié)構(gòu)，而7種非結(jié)構(gòu)蛋白雖不能構(gòu)成病毒的主要結(jié)構(gòu)，但在基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程中提供重要的酶類等物質(zhì)，以保障病毒的正常繁殖代謝。在其兩側(cè)為5′和3′非編碼區(qū)(UTRs)，在3′非編碼區(qū)的末端含有一個(gè)長(zhǎng)度可變的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)[6]。病毒衣殼是由VP1、VP2、VP3 和VP4構(gòu)成，VP4是被包埋在病毒衣殼內(nèi)部的，一般感染機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，而其他VP1、VP2和VP3 三種結(jié)構(gòu)蛋白暴露在病毒的表面，是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要部位。在VP1蛋白上有最主要的抗原抗原結(jié)合位點(diǎn)，VP2、VP3和VP4蛋白與病毒衣殼的理化特性及某些穩(wěn)定性有關(guān)又是其重要的組成部分。非結(jié)構(gòu)蛋白中的各種蛋白多數(shù)與酶的活性有關(guān)，如2A具有半胱氨酸蛋白酶活性，2C具有ATP酶活性；也有在RNA的復(fù)制過(guò)程中起到重要作用的蛋白，如3B在與RNA 5′末端的pUpU形成磷酸二酯鍵之后啟動(dòng)RNA的合成，2B和3A參與并促進(jìn)RNA早期的復(fù)制，隨后在3D蛋白的作用下引起病毒RNA的復(fù)制并在3C水解酶蛋白的促進(jìn)作用下可導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡[7]。牛腸道病毒其它腸道病毒相比，在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)與三葉草結(jié)構(gòu)之間多了100個(gè)核苷酸[8]。5’UTR可通過(guò)與細(xì)胞蛋白因子的相互結(jié)合從而調(diào)控病毒基因組的合成及蛋白翻譯，VPg蛋白結(jié)合在5'末端之后與聚合酶3D相互作用，啟動(dòng)病毒RNA的復(fù)制[6]。3'UTR末端含有的(poly A)與病毒的感染性、基因組復(fù)制及mRNA的合成效率相關(guān)[6]。

A：牛腸道病毒粒子模擬結(jié)構(gòu)；B：腸道病毒粒子剖面圖；C：牛腸道病毒的電鏡圖片(100000×)；D：腸道病毒基因結(jié)構(gòu)示意圖圖1 腸道病毒粒子及衣殼結(jié)構(gòu)

BEV粒子無(wú)囊膜，故對(duì)乙醚、脫氧膽酸鹽、去污劑以及氯仿有一定的抵抗力，也能抵抗蛋白水解酶的作用。此外牛腸道病毒還能抵抗弱酸條件如pH3.0、常見(jiàn)的消毒劑如70%乙醇和5%甲酚皂溶液等。這些理化特性決定了該病毒可在自然環(huán)境中存活數(shù)月之久。但牛腸道病毒在堿(pH10.0 以上)、高溫(50 ℃以上，鈣、鎂離子存在時(shí)除外)和紫外線照射等條件下1 h左右便可被滅活[9]。1.2 BEV的分類及鑒定方法 BEV的分子型根據(jù)5′UTR和衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)分為BEV-E(原BEV-A)和BEV-F(原BEV-B)兩大類。在BEV檢測(cè)分型過(guò)程中病毒分離物或原始標(biāo)本首先以5′UTR鑒定為小RNA病毒科病毒。VP1蛋白是最主要的衣殼蛋白，具有最多的型特異性中和位點(diǎn)，因此VP1 蛋白編碼基因序列與病毒血清型具有較高的相關(guān)性，通過(guò)擴(kuò)增全長(zhǎng)VP1序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)比VP1區(qū)核酸同源性與已知血清型腸道病毒同源性<70%(氨基酸同源性<85%)則認(rèn)為所測(cè)病毒與標(biāo)準(zhǔn)株不是同一血清型，為一新血清型[3]。VP1作為BEV分型的主要依據(jù)已經(jīng)被普遍認(rèn)可，但隨著VP1序列數(shù)據(jù)的不斷擴(kuò)大，部分毒株的情況不符合70%/85%的分類標(biāo)準(zhǔn)，比如獲得的VP1序列不完整，則要獲得更多的信息如P1全序列、中和試驗(yàn)結(jié)果及免疫電鏡圖片等來(lái)進(jìn)行綜合判定。

BEV血清型的分型經(jīng)歷了幾次重要的變動(dòng)。1985年Knowles等[10]將BEV的分型標(biāo)準(zhǔn)確定為2個(gè)血清型(BEV-1和BEV-2)。2006年Zell等[11]通過(guò)對(duì)已知的牛腸道病毒的 5′UTR、VP1、VP2、VP3、VP4和3D 的序列進(jìn)行了比對(duì)分析后確定了該病毒其實(shí)可以分為BEV-A 與 BEV-B兩個(gè)大群。目前，世界公認(rèn)的BEV的分類標(biāo)準(zhǔn)是在第九次病毒委員會(huì)分類報(bào)告[12]上公布的EV-E(即BEV-A)與 EV-F(即BEV-B)兩種，前者包括E1～E4共四種基因型，后者分括F1～F7共六種基因型。

2 BEV的流行現(xiàn)狀

一般認(rèn)為BEV是牛腸道中原有的棲居者，在腸道中增殖，病原性并不明顯。大多數(shù)人認(rèn)為牛腸道病毒可引起呼吸道疾病、繁殖障礙和流產(chǎn)等臨床癥狀，BEV在發(fā)生多種臨床癥狀(呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、繁殖障礙性疾病)牛群中都得到了分離，甚至是假定健康的牛群動(dòng)物中也能夠得到分離[13]。

2.1 國(guó)外的流行現(xiàn)狀 自1959年Moll和Davis首次分離到BEV以來(lái)[14]，全世界很多國(guó)家和地區(qū)先后報(bào)道了BEV的感染情況，在國(guó)外牛群中的流行率約為17.6%～80%[15]。2002年Ley等[16]研究發(fā)現(xiàn)與封閉牛群畜牧業(yè)相關(guān)的環(huán)境,包括加拿大白尾鹿、加拿大鵝、動(dòng)物的飲用水源和牧場(chǎng)下游的臨近河牡蠣都能夠通過(guò)RT-PCR等方法檢測(cè)的到BEV的存在，其中白尾鹿糞便的陽(yáng)性率為38%，牛糞便的陽(yáng)性率為76%。并對(duì)所檢測(cè)的BEV進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)并不完全屬于同一型別。2007年Zheng等[17]從澳大利亞刷尾負(fù)鼠體內(nèi)腸道內(nèi)容物中分離得到兩株牛腸道病毒W(wǎng)1與W6，均屬于BEV-2型。2008年S Gur等[15]對(duì)土耳其部分地區(qū)不同物種BEV-1感染情況進(jìn)行了血清學(xué)檢測(cè)，其中包括244份人血清、1520份牛血清，檢測(cè)結(jié)果表明人血清陽(yáng)性率為30.3%，牛血清陽(yáng)性率為64.8%，這是首次在人血清中檢測(cè)到BEV的抗體，但其是否能夠引起人類的一些臨床癥狀尚未可知。2012年A′kos Boros等[13]從健康羊糞便樣本中利用5′UTR和VP1基因序列鑒定并分離出了一株自然種間重組的豬/牛腸道病毒OEV-1，同時(shí)也首次獲得了該毒株的全基因序列。2013年McClenahan等[4]在因呼吸道疾病致死的羊駝肺組織樣品中首次分離得到一株BEV，經(jīng)后續(xù)試驗(yàn)鑒定其為EV-F。2015年Sobhy等[18]從嚴(yán)重腹瀉的牛體內(nèi)分離到了一株BEV-F2型。

2.2 國(guó)內(nèi)的流行現(xiàn)狀 在國(guó)外，BEV的流行及傳播比較普遍，但在中國(guó)有關(guān)BEV疾病的報(bào)告卻還沒(méi)有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析。但近幾年已多次報(bào)道新型BEV的發(fā)現(xiàn)，比如2011年李英利等[19]報(bào)道過(guò)從內(nèi)蒙古地區(qū)的犢牛糞便中分離出了1株BEV，命名為BHM26，并且分析表明中國(guó)BEV分離株與國(guó)外參考毒株具有較大差異但未鑒定其基因型；2013年侯佩莉等[20]從山東地區(qū)的泌乳奶牛的腹瀉糞便樣本中分離出了BEV，命名為BEV-SD。同年，彭小薇等[21]從北京某牛場(chǎng)的泌乳奶牛的腹瀉樣本中分離獲得1株牛腸道病毒2型，命名為BJ001，之后又對(duì)分離株進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析；2014年從吉林省一個(gè)發(fā)病率和死亡率較高的牛場(chǎng)分離到三株E種BEV，命名為HY12[22]，從北京地區(qū)某牛場(chǎng)分離到一株F種BEV[23]；2015年張海麗等[24]從山西某奶牛場(chǎng)的泌乳奶牛糞便樣品中分離得到一株BEV。

從以上數(shù)據(jù)可以初步分析國(guó)內(nèi)外BEV均有E型和F型的毒株出現(xiàn)，同時(shí)國(guó)內(nèi)的分離株多數(shù)是屬于新型分離株，也豐富了BEV屬的種類。該病毒在國(guó)內(nèi)外的流行差異主要在于感染物種的不同，國(guó)內(nèi)現(xiàn)在僅在反芻動(dòng)物體內(nèi)監(jiān)測(cè)的到該病毒的存在，如牛、羊等；而國(guó)外的感染譜相對(duì)比較廣泛，除了牛、養(yǎng)外，還可在羊駝、鹿、豬、馬、鵝、鼠，甚至在人類的血清中都能夠監(jiān)測(cè)的到該病原的存在。對(duì)此，在我國(guó)未來(lái)的牛腸道病毒的研究發(fā)展中應(yīng)該擴(kuò)大檢測(cè)的物種范圍，更加全面系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)BEV在我國(guó)的感染譜及流行率。

3 BEV的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

通常多數(shù)研究者認(rèn)為牛腸道病毒的病原性不明顯，廣泛存在于自然界中，其宿主范圍較廣，能夠在一定條件下如侵入其他組織或是繼發(fā)感染和混合感染其他病原時(shí)引起顯著的癥狀進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物疾病的發(fā)生，造成經(jīng)濟(jì)損失[12]，因此簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)技術(shù)對(duì)BEV的監(jiān)控和防治是非常必要的。

目前已報(bào)道的牛腸道病毒的檢測(cè)技術(shù)主要有傳統(tǒng)的電鏡檢查、病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)和TaqMan熒光定量PCR等。2005年Jimenez-Clavero等[25]針對(duì)BEV 5′UTR基因建立了相關(guān)的RT-PCR檢測(cè)方法并對(duì)西班牙的多個(gè)地區(qū)的牛、綿羊、山羊、驢、馬以及地表水樣進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果數(shù)據(jù)表明，除了在驢的檢測(cè)樣本中未檢測(cè)到，其余均有陽(yáng)性樣本存在；2016年Nathamon等[26]根據(jù)5′UTR基因設(shè)計(jì)引物(長(zhǎng)約290 bp)建立了RT-PCR的方法并對(duì)泰國(guó)部分地區(qū)的本地牛、印度牛及山羊攜帶BEV的感染率做了一個(gè)調(diào)查和分析，結(jié)果表明，以上幾種動(dòng)物均有BEV的攜帶，其中本地牛的攜帶率最高(76%)。2012年我國(guó)學(xué)者吳丹等[27]根據(jù)5′UTR基因建立了檢測(cè)BEV的TaqMan定量PCR方法，并對(duì)大量的臨床樣本進(jìn)行了臨床檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有較好的特異性而且敏感性比病毒分離法高10倍。2015年朱彤[28]和2014年侯佩莉等[20]分別針對(duì)其3D 基因建立了RT-PCR和TaqMan定量PCR方法，兩者所建立的該方法與引起牛的病毒性腹瀉的其它幾種牛的病毒(牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛冠狀病毒(BCoV)等)均無(wú)交叉反應(yīng),前者所建立的方法檢出敏感度達(dá)7.13×10-1拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高10倍，后者所建立的檢測(cè)方法的敏感度也較高，達(dá)10-1TCID50。血清學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)展較緩慢，最近幾年有所增多，在2014年郭金玉等[29]利用北京某牛場(chǎng)牛腸道病毒2型(BEV-2) 分離毒株的VP1蛋白構(gòu)建了BEV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。2015年朱彤等[28]通過(guò)擴(kuò)增BEV的VP2基因并進(jìn)行一系列的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)、純化出重組蛋白制備了較高效價(jià)的多克隆抗體，為BEV的血清學(xué)診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。2016年邢澤黎等[30]應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)純化的E種腸道病毒的 VP1和VP2重組蛋白制備了抗體，并建立了檢測(cè)BEV病原的雙抗體夾心ELISA 方法，該檢測(cè)BEV的抗原方法具有特異性、靈敏度高和快速等特點(diǎn)，并對(duì)吉林省不同地區(qū)的牛群感染BEV進(jìn)行了病原流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)牛群的BEV感染率為8.16%～58.7%。

4 BEV致病機(jī)制的研究現(xiàn)狀

BEV的致病性有些爭(zhēng)議，有認(rèn)為只引起輕度腹瀉或健康牛的隱性感染，致病性弱，也有認(rèn)為可引起呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉、產(chǎn)奶量下降、睪丸炎、包皮炎、黏膜炎、流產(chǎn)、死胎、盲腸結(jié)腸炎等臨床癥狀[13]，這可能是由于不同血清型的病毒對(duì)不同組織的嗜性不同而引起的疾病也不同，其致病性機(jī)理還不是很清楚。由于其臨床癥狀在臨床實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中很難被復(fù)制，因而BEV和機(jī)體之間的相互作用、致病機(jī)理等相關(guān)研究仍處于初步研究的階段。

1980年Yilma等[31]研究BEV感染細(xì)胞后，通過(guò)免疫熒光抗體標(biāo)記后觀察病毒感染細(xì)胞的過(guò)程，來(lái)研究牛腸道病毒組裝和釋放的形態(tài)變化及發(fā)生過(guò)程，證實(shí)病毒通過(guò)囊泡釋放到細(xì)胞外，部分也存在于細(xì)胞質(zhì)泡中。2011年Blas-Machado等[32]第一次使用BEV-1株通過(guò)回歸原動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法感染犢牛并觀察BEV-1的致病機(jī)制，結(jié)果表明，感染組中觀察到了一定程度的腹瀉、呼吸窘迫及厭食等相似的臨床癥狀，但在對(duì)照組中也出現(xiàn)了腹瀉等現(xiàn)象，由于缺乏嚴(yán)格的對(duì)照動(dòng)物導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)不能夠準(zhǔn)確的分析其致病機(jī)理，但其在某種程度上也可說(shuō)明BEV-1株能夠感染犢牛并且可能具有與其它腸道病毒類似的致病機(jī)制。2014年Zhang等[33]獲得了新型BEV的分離株并利用50 μL/只的病毒量腹腔注射剛出生1d的乳鼠，結(jié)果表明可在其心、肝、肺、腸道以及排泄物中檢測(cè)的到病毒的存在，說(shuō)明該病毒能夠引起呼吸道和消化道的感染。2015年蓋小春等[34]也利用BEV-E種的HY12建立了小鼠的動(dòng)物感染模型，結(jié)果表明只有IRC系小鼠能夠成功感染該病毒株，但昆明小鼠和BALB/c不能。小鼠成功感染病毒后其部分實(shí)質(zhì)器官和腸道組織都能夠出現(xiàn)程度不一的組織病理學(xué)的變化，如肺臟、肝臟、腦等器官內(nèi)產(chǎn)生了大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分組織的結(jié)構(gòu)消失，腸道上皮細(xì)胞脫落，腸壁增厚等等。免疫組織化學(xué)方法在機(jī)體的實(shí)質(zhì)器官和腸上皮細(xì)胞中檢測(cè)到了較多的BEV陽(yáng)性細(xì)胞，表明該病毒株可以通過(guò)不同途徑感染IRC系小鼠，并可以在不同的器官、組織中進(jìn)行病毒復(fù)制。這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果都為研究BEV的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

5 小結(jié)

BEV是國(guó)內(nèi)近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種動(dòng)物疾病，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，我們國(guó)內(nèi)的牛群中既有E種牛腸道病毒也存在F種牛腸道病毒的感染，且兩種血清型之間存在較大差異，給本病的分子流行病學(xué)的調(diào)查和確診造成了一定的困難。同時(shí)，BEV粒子的大小、形態(tài)與細(xì)小病毒的極為相似，應(yīng)用電鏡觀察也常常造成誤診。目前關(guān)于BEV疾病的診斷和防治還是處于缺乏狀態(tài)。對(duì)于新型BEV的分離鑒定確定血清之后，多數(shù)BEV的致病機(jī)制、發(fā)病機(jī)理都還處于初步研究階段，動(dòng)物模型的建立也還不夠完善，比如最佳的感染途徑和劑量、動(dòng)物病例的完整復(fù)制、病理組織的變化分析等發(fā)病機(jī)理還不夠清楚。我國(guó)雖在近幾年有關(guān)注BEV的動(dòng)態(tài)，但國(guó)內(nèi)還沒(méi)有系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)和相對(duì)應(yīng)的管理制度，因?yàn)锽EV的感染可引起的臨床癥狀如發(fā)熱、咳嗽、腹瀉等，也會(huì)由于和替他病毒的混合感染引起流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降等；而且有的病毒株是隱性感染，但也有些毒株可引起動(dòng)物的死亡，因而關(guān)于BEV的致病性也一直存在著爭(zhēng)議，對(duì)此，我們應(yīng)該在今后的研究中努力完善這些不足。

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(編輯：李文平)

Research Progress on Bovine Enterovirus

HE Huan, ZHANG Bin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China)

Bovine enterovirus has begun to gradually popular in recent years in China. It had discovered that many novel bovine enteroviruses, meanwhile there are lots of researchs on establishing of molecules and serotypes. In this study, the basic structures, isolation, detection methods, prevalence and pathogenesis of bovine enterovirus were introduced in detail, which provide a basis for further study of the epidemic status and control measures of bovine enterovirus in China.

bovine enterovirus; isolation; detection methods; pathogenesis

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目青年基金(2014JQ0044);西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2016NGJPY10)

何歡,碩士研究生,從事動(dòng)物病原分子生物的研究。

張斌。E-mail:binovy@sina.com

2016-10-21

A

1002-1280 (2017) 01-0063-06

S852.653