丁英慶+付煜鑫+徐波+薛樹平+張炯+劉萍

摘要：為研究自然條件下溶藻菌RZ14菌株治理水華的效果，在調(diào)查泉城公園景觀水體富營養(yǎng)化狀況的基礎上，選取水華較嚴重的映日湖作為該溶藻菌劑原位生物控制的測試水域，對該湖區(qū)葉綠素a、有機質(zhì)、氨氮及總磷變化進行跟蹤測定。結果表明，映日湖水華現(xiàn)象嚴重，未達到一般景觀用水V類標準，屬重度營養(yǎng)化。經(jīng)該溶藻菌劑生物治理后，水華消除，葉綠素a含量低于0.05 mg/L，CODCr清除率50.01%，BOD5清除率73.38%，氨氮清除率70.51%，總磷清除能力88.59%。通過原位試驗，表明RZ14抑藻劑能快速消除水華現(xiàn)象，對富營養(yǎng)化水體治理效果顯著，可開發(fā)為溶藻菌劑應用于藍藻水華的治理。

關鍵詞：水華；富營養(yǎng)化；溶藻菌；生物修復

中圖分類號：X524 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5214-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.013

Abstract： For study of the algicidal bacterium RZ14 stains control effect under natural conditions of water blooms，Yingri pool where blooms had happened seriously were carried on in-situ bioremediation based on the investigation of eutrophication on Quancheng park landscape water body. And chlorophyll a content，organic matter content，ammonia nitrogen content and total phosphorus content were measured before and after bioremediation. The results showed that the bloom phenomenon was serious in Yingri pool. Water quality were not up to the general landscape water standard（class V），belonging to hyper eutropher. After biological agent treatment，blooms disappeared，chlorophyll a content was lower than 0.05 mg/L，CODCr removal rate was 50.01%，BOD5 removal rate reached 73.38%，NH4+-N removal rate reached 70.51%，and total phosphorus removal rate reached 88.59%. In-situ experiments showed that RZ14 algal inhibiter agent could quickly eliminate water blooms. And it had a notable effect on eutrophic water body. Algicidal bacterium RZ14 might be developed algicide to control cyanobacteria blooms.

Key words： blooms； eutrophication； algicidal bacterium； bioremediationt

水體富營養(yǎng)化是引起水華藍藻暴發(fā)的主要原因，不僅造成生態(tài)環(huán)境的惡化，藍藻產(chǎn)生的毒素對魚類、哺乳動物乃至人類健康造成極大威脅，尤其是景觀水體發(fā)生水華后，對旅游產(chǎn)業(yè)也會造成重大經(jīng)濟損失[1-3]。目前，水體富營養(yǎng)化治理措施主要包括物理、化學和生物法[4，5]。物理和化學法對富營養(yǎng)化水體的控制技術相對比較成熟，但對于開放性湖泊、河流的控制還存在很大的局限性，尤其是化學方法造成的二次污染對生態(tài)環(huán)境帶來極大的破壞。而生物控制技術在這方面表現(xiàn)了其優(yōu)越性，植物浮床去除水體氮、磷等元素效果顯著，而利用微生物措施對環(huán)境進行治理，更受到國內(nèi)外環(huán)境工作者的普遍關注。尤其是具有溶藻活性的微生物對環(huán)境友好，二次污染較低，能高效控制水華和赤潮藻種[6-10]。但溶藻菌是否可以吸附、轉化、吸收和降解水體的有機物質(zhì)、N、P等元素，達到治理水體富營養(yǎng)化的目的，還需進一步研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)，擬采用的溶藻菌RZ14菌株菌體細胞溶藻效果不顯著，但其培養(yǎng)液對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）具有完全溶藻抑藻活性。故將該菌發(fā)酵后制成抑藻劑，以濟南泉城公園景觀湖泊作為測試點，研究了該菌株在自然環(huán)境下對富營養(yǎng)化水體的控制效果。濟南泉城公園有兩大景觀水系，采用生物污水處理后的中水作為水源，其水源含有較高濃度的N源及P源，加上其他污染因素，導致各景觀水系水體質(zhì)量顯著下降。近幾年各湖區(qū)水華頻繁暴發(fā)，甚至部分水域散發(fā)惡臭氣味，景觀水體生態(tài)功能遭到嚴重破壞。本研究在調(diào)查泉城公園各湖區(qū)水體狀況的基礎上，選取映日湖作為測試湖區(qū)，采用原位生物治理措施，研究了RZ14菌株對富營養(yǎng)化水體中的藻類、氮、磷及有機質(zhì)的去除效果，其研究結果為溶藻菌劑修復富營養(yǎng)化湖泊提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種分離純化與培養(yǎng)

采集水樣后接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基進行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃，轉速150 r/min。發(fā)酵48 h后，以體積比1∶10，接入處于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻培養(yǎng)瓶中進行共培養(yǎng)，銅綠微囊藻藻種購于中國科學院武漢水生生態(tài)研究所，藻種編號905，屬高產(chǎn)毒藻種。培養(yǎng)溫度26 ℃，光照800 lx，光暗周期12 h/12 h。觀察藻液黃化狀況，從發(fā)生黃化的藻液中分離目的菌種。利用涂布平板法獲得初試菌株，反復進行溶藻測試后，選擇溶藻效果較好溶藻菌株RZ14進行液體發(fā)酵罐發(fā)酵。發(fā)酵72 h后的細菌菌液作為菌劑來源。

1.2 RZ14菌株細胞形態(tài)觀察及溶藻性能測試

將RZ14菌株接種于LB固體平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)16 h后，對菌體細胞進行經(jīng)典革蘭氏染色，利用FR-988生物顯微圖像分析系統(tǒng)對菌體進行觀察，并測定細胞大小。

溶藻測試取發(fā)酵72 h的菌體培養(yǎng)液離心，濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，鏡檢無菌后，取5 mL無菌濾液接種于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻培養(yǎng)瓶，藻液體積50 mL。對照添加相同體積的無菌液體培養(yǎng)基，每個處理設3個重復。藻液初始吸光度為OD687=0.354，初始葉綠素含量1.061 8±0.036 7 mg/L，培養(yǎng)條件26 ℃，光照800 lx，光暗周期12 h/12 h。在663、645、630、750 nm波長下測定吸光度，按照以下公式計算葉綠素a含量，同時對藻體進行顯微觀察。

葉綠素a（mg/L）=11.64×（OD663-OD750）-2.16×（OD645-OD750）+0.1×（OD630-OD750）

1.3 菌劑投加方式

試驗自6月10日始投加RZ14菌劑，連續(xù)投加6 d，并進行曝氣。7月2日，繼續(xù)投加該菌劑，每隔5 d投加一次，連續(xù)投加3次。投放濃度為10 mg/L。水體采樣標志用浮標法，每次采集5點，根據(jù)外觀變化進行取樣檢測。

1.4 水體測定項目及評價方法

CODMn采用高錳酸鉀指數(shù)法測定；CODCr采用重鉻酸鉀法測定；BOD5采用稀釋接種法測定；TN采用過硫酸鉀-紫外分光光度法測定；氨氮采用納氏試劑光度法測定；TP采用鉬銻抗分光光度法測定；葉綠素a（Chla）采用分光光度法測定；透明度（SD）采用塞氏盤測定；DO采用溶解氧儀測定。測試數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行方差分析。

映日湖面積約7 700 m2，平均水深1 m，沿岸種植水生植物，水面建設有浮島，屬于沉淀的封閉類型。水源來自公園西南角與東北角的三站和四站，其中三站污水處理工藝采用ETS生態(tài)處理系統(tǒng)，四站采用一級強化濾料處理工藝。水質(zhì)監(jiān)測結果中，選取5個主要的指標（CODMn、葉綠素Chla、總磷TP、總氮TN、SD）參與富營養(yǎng)化的評價，采用綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)法對湖區(qū)水質(zhì)現(xiàn)狀調(diào)查結果進行評價。

2 結果與分析

2.1 RZ14菌株細胞形態(tài)觀察

RZ14菌株顯微觀察如圖1所示。RZ14菌株細胞呈桿狀，細胞大小為0.533～0.947 μm×1.593～2.024 μm，革蘭氏染色陽性，芽孢中生。

2.2 RZ14菌液對銅綠微囊藻細胞生長的影響

在共培養(yǎng)3 d后，RZ14處理組葉綠素含量開始下降，但此時藻液并未出現(xiàn)黃化。至培養(yǎng)5 d時，該處理組藻液發(fā)生黃化現(xiàn)象；培養(yǎng)7 d，藻液完全變白，底部有白色沉淀物，此時葉綠素含量降至1.009 6 mg/L，而對照組葉綠素含量持續(xù)增高至1.569 5 mg/L；共培養(yǎng)23 d，RZ14處理組葉綠素含量仍持續(xù)下降，其含量為0.249 5 mg/L（圖2）。在共培養(yǎng)8 d時，對各處理組藻細胞進行顯微鏡檢，用改良苯酚品紅溶液染色20 min，顯微觀察結果見圖3。CK組銅綠微囊藻細胞仍以集群方式生存，而RZ14菌液處理組藻細胞發(fā)生解體，未觀察到完整的藻細胞，圖3B可清楚觀察到藻細胞膜殘體。室內(nèi)測試結果顯示，該菌株能明顯導致銅綠微囊藻細胞的裂解。

2.3 映日湖水質(zhì)分析及營養(yǎng)狀況評價

映日湖水體多年發(fā)生水華，湖區(qū)表面漂浮綠色的浮萍，部分區(qū)域散發(fā)惡臭氣味。水質(zhì)分析（表1）顯示，除TP含量略低（<0.5 mg/L）外，葉綠素、有機質(zhì)、總氮含量都較高，水體透明度不足20 cm，水體質(zhì)量未達到《地面水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB3838-83）V類水質(zhì)標準，即達一般景觀水體標準。映日湖水源本身是生活污水處理后的水，由于其處理工藝的限制，氮磷含量相對較高，再加上雨水、生活污水、沖刷路面污水等外源污染物流入，綜合營養(yǎng)指數(shù)法評價結果顯示為重度富營養(yǎng)，污染極其嚴重。

2.4 RZ14菌劑使用后水質(zhì)變化狀況

2.4.1 抑藻劑對兩湖水體CODCr的影響 投放抑藻劑后，映日湖水體化學需氧量降低較明顯，后期略有提高，與36 d測定結果差異并不明顯（圖4）。在處理5 d時，化學需氧量有明顯的降低，與未處理測定結果有顯著差異，隨后持續(xù)下降，在處理36 d時降至最低。在處理后54 d，化學需氧量的清除率為50.01%。

2.4.2 抑藻劑對水體BOD5的影響 抑藻劑對映日湖水體BOD5去除效果非常顯著，54 d清除率達73.38%（圖5）。在菌劑投放初期，水體中生化需氧量有輕微波動，較處理前略有提高，但與處理前差異不明顯，這可能是溶藻菌劑本身造成的，也可能是由于藻細胞裂解后，向水體釋放有機物質(zhì)造成生化需氧量有所提高。處理36 d生化需氧量基本降至最低，處理54 d時，含量雖略有下降，但與36 d測定結果未達顯著差異。

2.4.3 抑藻劑對水體氨氮及總磷的影響 投放抑藻劑后，映日湖氨氮含量、總磷含量都有不同程度的降低（圖6、圖7）。從圖中可見，在處理初期，水體氨氮及總磷含量皆無明顯變化，在處理36 d時，氨氮及總磷含量明顯下降，隨后，氨氮含量略有提高，但是總磷含量持續(xù)降至最低，至處理54 d時，氨氮及總磷清除率分別達70.51%和88.59%。

2.4.4 抑藻劑對水體葉綠素a的影響 映日湖水華暴發(fā)已多年，投放該菌劑后，藍藻水華明顯得到控制，水體葉綠素a含量大幅度下降，在處理10 d時，葉綠素a含量即有明顯降低；至處理22 d時，水體葉綠素a含量降至0.054 mg/L，隨著處理時間延長，葉綠素a含量仍有下降，但變化不顯著，至處理47 d時，葉綠素含量降至0.045 mg/L（圖8）。葉綠素濃度可直接指示水體藻類的生物量，可見抑藻劑能明顯抑制藍藻生長，消除藍藻水華。

3 小結與討論

泉城公園映日湖水體處于重度營養(yǎng)化狀態(tài)，經(jīng)過RZ14菌劑治理后，影響水體最嚴重的水華現(xiàn)象得到有效控制，水面藍藻消失，葉綠素a含量大幅度下降，CODCr清除率達50.01%，BOD5清除率達73.38%，氨氮清除率達70.51%，總磷清除率達88.59%?？梢?，RZ14菌株能有效去除水華現(xiàn)象，對富營養(yǎng)化水體治理效果明顯。

自然水體中，藍藻與異養(yǎng)生物細菌之間有著密切的關系，這種關系表現(xiàn)在共生、拮抗或中性[11]，已發(fā)現(xiàn)某些細菌能分泌藻類生長促進劑，如植物激素吲哚乙酸（IAA）[12]，而某些細菌可釋放除藻劑，目前研究工作主要集中在對有害藍藻的控制方面[13，14]。張將[15]研究了一株溶藻菌株S4的菌劑生產(chǎn)工藝，認為該溶藻細菌發(fā)酵液可以直接投入發(fā)生水華的水體，也可以輔以一定載體。其烘干后的粉狀溶藻菌劑在1∶2 000的投加比例下，4 d后溶藻效率可達86.41%。本研究在自然水域的溶藻效果研究中也得到了類似結果。在投放菌劑3 d后，即觀察到湖面水華藍藻出現(xiàn)集聚現(xiàn)象，分布面積逐漸減少，7 d后基本消除，湖水呈綠色。葉綠素分析結果也顯示，在處理10 d時，葉綠素含量明顯下降，與處理前比較呈顯著差異?？梢娎萌茉寰_發(fā)生物菌劑具有廣泛的前景。伊揚磊[16]研究了一株不動桿菌屬溶藻菌對銅綠微囊藻毒素分泌的影響，96 h后藻體細胞胞內(nèi)毒素減少了51.4%，胞外毒素減少了53.0%。本研究僅對水華藍藻生長及菌劑投放后水體有機物質(zhì)、氨氮及總磷等進行了分析測定，未涉及藍藻細胞藻毒素的釋放及變化情況，雖然近兩年跟蹤觀察結果顯示，映日湖水體生態(tài)功能恢復，生物多樣性增加，但該溶藻菌的生態(tài)安全性問題仍有待深入探討。

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