黃菊+史小琴

摘要：為優(yōu)化超聲輔助乙醇浸提蕎麥（Fagopyrum esculentum）中蘆丁的工藝條件，利用響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥蘆丁提取工藝，以蘆丁提取量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)探討超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響。結(jié)果表明，獲得的最佳工藝為超聲時(shí)間23 min、超聲溫度79 ℃、液料比30∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%。交互作用影響顯著的因素為超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，蕎麥蘆丁的提取量為0.416 1 mg/g，與模型預(yù)測值0.428 8 mg/g基本相符。模型可以較好地預(yù)測蕎麥蘆丁的提取量，響應(yīng)面法對(duì)蕎麥蘆丁提取條件參數(shù)優(yōu)化具有可行性。

關(guān)鍵詞：蕎麥（Fagopyrum esculentum）；超聲波；蘆?。豁憫?yīng)面法

中圖分類號(hào)：S517；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5327-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.040

Abstract： In order to optimize the technological condition of ultrasonic-assisted ethanol extraction of rutin from Fagopyrum esculentum， taking the yield of rutin as the index， The effects of four main variables， i.e.， ultrasound time， ultrasound temperature， liquid-solid ratio and percentage of ethanol concentration on the extraction yeild of rutin were discussed by single-factor experiments， the optimal process of extracting rutin from Fagopyrum esculentum were obtained by response surface methodology. The results showed that， the optimum extraction conditions were as follows： extraction time of 23 mins， extraction temperature of 79 ℃， liquid-solid ratio of 30∶1 and ethanol concentration of 90%. The interactions were prominent between ultrasound time and ethanol concentration， also between extraction temperature and ethanol concentration. Under these conditions， a mean value of 0.416 1 mg/g（n=3） was observed， which was well matched with the predicted value of 0.428 8 mg/g. The proposed prediction model could accurately predict the extraction yield of rutin， which suggested it was feasible to optimize the extraction conditions of rutin from Fagopyrum esculentum using response surface methodology.

Key words： Fagopyrum esculentum； ultrasonic； rutin； response surface methodology

蕎麥（Fagopyrum esculentum）中含有大量的黃酮類化合物，其醇提物的主要成分為蘆丁[1]。它具有顯著的降糖功效，因而受到糖尿病患者的青睞，并被廣泛用于降糖食品的研究開發(fā)[2]。從蕎麥中提取蘆丁的方法有索氏回流提取、熱水浸提法和堿提酸沉等，賈冬英等[3]進(jìn)行了系統(tǒng)的對(duì)比研究，認(rèn)為乙醇浸提法操作簡單，溶劑可回收、無毒害，是行之有效的提取方法。但在實(shí)際應(yīng)用中因時(shí)間長、能耗大等因素限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。而隨著分離技術(shù)的進(jìn)步，超聲波、微波和超臨界萃取等輔助提取天然植物中有效成分的新方法不斷發(fā)展起來，在一定程度上縮短時(shí)間，節(jié)約了能耗，從而達(dá)到了提高生產(chǎn)效率的目的。超聲波提取技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械騷動(dòng)效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)和空化效應(yīng)等物理化學(xué)過程來加速物質(zhì)的擴(kuò)散溶出而提高提取效率的一種較實(shí)用的提取方法[4，5]。將超聲波用于蕎麥黃酮的提取已有研究，文獻(xiàn)[6-9]選擇的原材料均為蕎麥麩皮，優(yōu)點(diǎn)是蕎麥麩皮中黃酮類化合物含量較高，能夠得到較高的提取率，但大量收集蕎麥麩皮也存在一定困難。陳國安等[10]直接以蕎麥為原料，采用響應(yīng)面法確定了超聲輔助提取蕎麥黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲溫度35 ℃，超聲時(shí)間30 min，液固比45∶1（mL∶g），此時(shí)，苦蕎黃酮提取率為6.92%。

本研究擬在借鑒現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，利用超聲波輔助乙醇浸提蕎麥中的蘆丁，通過響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)獲得的蕎麥蘆丁提取工藝模型進(jìn)行深入分析，并討論雙因素間的交互作用，以期為蕎麥蘆丁的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥產(chǎn)地為山東棗莊；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DB型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；722型可見分光光度計(jì)（配有1 cm比色皿）（上海悅豐儀器儀表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥中蘆丁的提取 蕎麥→干燥粉碎→過30目篩→乙醇預(yù)先浸泡→超聲輔助提取→抽濾→濾液定容待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL容量瓶中配制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后分別移取0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL于25 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min， 10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，用乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min。配制成0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，于510 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）對(duì)濃度（c）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)最小二乘法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=7.775c+0.017 6，R2=0.994 5。說明在 0～0.10 mg/mL吸光度和蘆丁濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 蕎麥蘆丁含量測定 從蕎麥蘆丁的提取液中移取2 mL于25 mL容量瓶中，滴加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，然后滴加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，定容至刻度，搖勻靜置15 min后，于510 nm波長處測定吸光度。

式中，A為提取液吸光度；V0為蕎麥蘆丁提取液定容體積，mL；V1為蕎麥蘆丁提取液定容后吸取的體積，mL；V2為蕎麥蘆丁稀釋液定容體積，mL；m為蕎麥粉樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）超聲時(shí)間。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲溫度80 ℃、液料比30∶1（mL∶g，下同）和90%乙醇條件下，分別超聲提取10、20、30、40、50 min。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察超聲時(shí)間對(duì)蘆丁提取量的影響。

2）超聲溫度。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲時(shí)間20 min、液料比30∶1和90%乙醇條件下，按照超聲溫度40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行提取。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察超聲溫度對(duì)蘆丁提取量的影響。

3）液料比。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲時(shí)間20 min、超聲溫度80 ℃和90%乙醇條件下，按照液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1進(jìn)行提取。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察液料比對(duì)蘆丁提取量的影響。

4）乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取過30目篩的干燥蕎麥粉0.5 g，在超聲時(shí)間20 min、超聲溫度80 ℃和液料比30∶1的條件下，分別按照乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行提取。按照“1.3.3”的方法測定蕎麥蘆丁含量，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘆丁提取量的影響。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以上述4個(gè)因素為考察變量，蘆丁提取量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行，試驗(yàn)因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)提取量的影響 如圖1所示，蘆丁提取量隨著超聲時(shí)間的增加先增后減，在20 min左右形成拐點(diǎn)，分析可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長，由于存在強(qiáng)烈的振動(dòng)和熱效應(yīng)，使得蘆丁結(jié)構(gòu)部分被破壞，導(dǎo)致提取量減少。因此以超聲時(shí)間20 min為宜。

2.1.2 超聲溫度對(duì)提取量的影響 由圖2可知，40～70 ℃范圍內(nèi)隨著超聲溫度的增加，蘆丁提取量增加，超過70 ℃后，提取量下降。這主要是因?yàn)樘岣邷囟扔欣邳S酮類化合物的溶出，但溫度過高，會(huì)使得提取液中的有效成分被破壞，且雜質(zhì)的溶出量也增加，從而蘆丁提取量減少，因此最佳的超聲溫度為70 ℃左右。

2.1.3 液料比對(duì)提取量的影響 由圖3可知，隨著液料比地增加，蘆丁提取量先增后減，在30∶1時(shí)達(dá)到最大值，而后趨于平穩(wěn)略有下降。考慮到節(jié)約溶劑量的因素，以液料比30∶1為宜。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響 如圖4所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蘆丁提取量也不斷增加，達(dá)到80%～90%時(shí)，增加量逐漸平穩(wěn)，因此以80%乙醇為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，對(duì)超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

采用Design-expert 8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值蕎麥蘆丁提取量（Y）對(duì)編碼自變量超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）、液料比（X3）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=0.37+0.038X1+0.022X2+0.023X3+0.034X4-0.014X1X2-5.05×10-3X1X3+0.067X1X4-9.4×10-3X2X3+0.073X2X4-4.3×10-3X3X4-0.027X12-0.040X22-0.059X32-0.11X42，對(duì)該模型進(jìn)行回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，該模型的F=14.96，P<0.000 1，說明二次回歸方程是極顯著的，失擬項(xiàng)F=0.32，P=0.932 9，表明相對(duì)于純誤差，失擬現(xiàn)象不顯著。模型的確定系數(shù)R2=0.937 3，反映了回歸方程對(duì)響應(yīng)值的解釋能力為93.73%，而在多元回歸擬合中，自變量個(gè)數(shù)對(duì)方程擬合的優(yōu)度有影響，一般還需考慮調(diào)整確定系數(shù)R2Adj，本例中為0.874 7，它表明響應(yīng)值的總變異中有87.47%可由所選的4個(gè)獨(dú)立變量來解釋。模型變異系數(shù)為10.46%，表明模型具有較高的可靠性和精確性。綜上可知，該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以用于蕎麥蘆丁提取工藝的優(yōu)化。

從單因素的F值看出，各單因素對(duì)蘆丁提取量的影響順序?yàn)椋撼晻r(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>超聲溫度。此外，P（X1X4）和P（X2X4）都小于0.005，表明兩因素的相互作用中，超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蕎麥蘆丁提取量具有顯著的交互作用，其余兩因素間的交互作用不顯著。

2.3 雙因素間的交互影響作用分析

雙因素間的交互影響因素可以從響應(yīng)曲面圖上直觀的觀察，曲面圖坡度越陡峭，說明雙因素交互作用顯著，反之，坡度平緩則不顯著。從圖5可以看出，c和e的響應(yīng)曲面比較陡峭，說明超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蕎麥蘆丁提取量具有顯著的交互作用，在此將交互作用顯著的雙因素影響的等高線圖列出，如圖6所示。從圖6（左）可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，蘆丁提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增后減，當(dāng)超聲時(shí)間較長時(shí)，提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，提取量隨著超聲時(shí)間的增加略有下降；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，提取量隨著超聲時(shí)間的增加而增加。并且乙醇體積分?jǐn)?shù)地影響大于超聲時(shí)間對(duì)提取量地影響。因此，適當(dāng)?shù)卦黾右掖俭w積分?jǐn)?shù)并選擇合適的超聲時(shí)間，可以有效提高蘆丁提取量。

同理，圖6（右）可以看出，當(dāng)超聲溫度較低時(shí)，提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增后減，當(dāng)超聲溫度較高時(shí)，提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，提取量隨著超聲溫度的增加變化不明顯，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，提取量隨著超聲溫度地增加而增加，且乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響大于超聲溫度對(duì)提取量的影響。因此，選擇適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，并選擇合適的超聲溫度有利于提高蕎麥蘆丁的提取量。

根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果可得超聲輔助乙醇提取蕎麥中蘆丁的最佳工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間23 min，超聲溫度78.66 ℃，液料比30.20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)89.67%，此時(shí)蘆丁的理論提取量為0.428 8 mg/g。根據(jù)上述結(jié)果考慮實(shí)際情況，調(diào)整工藝參數(shù)為超聲時(shí)間23 min，超聲溫度79 ℃，液料比30∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到蘆丁的平均提取量為0.416 1 mg/g（RSD=1.89），比理論提取量低2.96%，表明響應(yīng)面法對(duì)蕎麥蘆丁提取工藝的優(yōu)化具有可行性。

3 結(jié)論

研究選擇超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)對(duì)蕎麥蘆丁提取量影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，建立了相應(yīng)的二次回歸方程。方差分析和響應(yīng)曲面分析表明，4個(gè)因素及其二次項(xiàng)對(duì)蕎麥蘆丁提取量具有顯著影響，同時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別與超聲時(shí)間和超聲溫度的交互影響顯著。

蕎麥蘆丁最佳的超聲提取工藝為：超聲時(shí)間23 min，超聲溫度79 ℃，液料比30∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，驗(yàn)證試驗(yàn)得到的蘆丁提取量為0.416 1 mg/g，低于理論預(yù)測值2.96%。表明該設(shè)計(jì)方法可用于蕎麥蘆丁超聲提取工藝的分析和預(yù)測，具有較高的可靠性。

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