于爽+高劍+郝婧瑋+何婷婷

摘要：利用響應(yīng)面法對白頭翁（Pulsatilla chinensis）皂苷的微波提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理及響應(yīng)面法分析并建立二次回歸模型。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波時間為考察因素，以白頭翁皂苷提取率為響應(yīng)值，研究了各因素對白頭翁皂苷提取率的影響。確定最佳微波提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率300 W、微波時間4 min，在此條件下，白頭翁皂苷提取率達(dá)到5.33%。

關(guān)鍵詞：白頭翁（Pulsatilla chinensis）；皂苷；微波輔助提??；響應(yīng)面法

中圖分類號：S567.23+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5348-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.045

Abstract：The response surface methodology was used to optimize the microwave-assisted extraction conditions of pulchinenoside. Based on the single factor experiment，a quadratic regression model was established using the principle of Box-Behnken central composite design and the response surface method. Taking the ethanol volume fraction，microwave power and irradiation time as investigation factors，and extraction rate of pulchinenoside as response value，the effects of various factors on the extraction rate of pulchinenoside were studied. The optimal extraction conditions determined were ethanol volume fraction of 50%，microwave power of 300 W，and extraction time of 4 min. Under these conditions，the extraction rate of pulchinenoside was 5.33%.

Key words：Pulsatilla chinensis；pulchinenoside；microwave-assisted extraction；response surface methodology

中藥白頭翁為毛茛科植物白頭翁（Pulsatilla chinensis）的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味苦寒，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲之功效[1，2]。它的化學(xué)成分有白頭翁皂苷、胡蘿卜甙、白頭翁素等，主要有效成分為白頭翁三萜皂苷[3，4]。現(xiàn)代藥理研究表明，它具有增強免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等作用[5，6]，尤其在抗腫瘤及抗癌的新藥開發(fā)方面有很大的應(yīng)用潛力[7，8]。近年研究還發(fā)現(xiàn)其所含的某些活性成分對治療老年性癡呆（阿爾茨海默病）效果顯著[9，10]。

微波輔助提取技術(shù)（MAE）利用每秒幾億次周期變化的微波透入物料內(nèi)，使物料內(nèi)的各部分在同一瞬間獲得能量促使細(xì)胞破裂，使細(xì)胞液溢出并擴散到溶劑中，從而達(dá)到提取有效成分的目的[11]，具有省時、高效，操作簡便、提取成本低等優(yōu)點[12]。本研究以白頭翁為原料，白頭翁皂苷B4含量為指標(biāo)，采用微波輔助溶劑提取白頭翁皂苷，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波時間等因素對白頭翁皂苷提取率的影響，并通過響應(yīng)面法對主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為白頭翁皂苷的綜合利用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白頭翁干燥根，購自牡丹江市老百姓大藥房；白頭翁皂苷B4標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，貴州迪大生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），J&K CHEMICAL LTD公司；甲醇、乙醇（分析純）；水為實驗室自制超純水。

SB-5200DTN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XH-MC-1型實驗室微波合成儀（祥鵠科技發(fā)展公司）；Waters 2695型高效液相色譜儀（Waters公司）；Waters 2998型紫外檢測器（Waters公司）；色譜柱（4.6 mm×150 mm）；MF 22R型臺式微量冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；BSA2245S-CW型電子分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；FZ102微型植物粉碎機（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取白頭翁皂苷B4標(biāo)準(zhǔn)品3.00 mg，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容配得濃度為0.600 mg/mL的母液，梯度稀釋為0.600、0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別標(biāo)記為1、2、3、4、5、6，經(jīng)4 000 r/min離心10 min后，依次取6組標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在檢測波長為201 nm，流動相為乙腈∶水∶磷酸（27∶73∶0.1），等度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min；25 ℃柱溫的高效液相色譜條件下進(jìn)樣10 μL。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.2 單因素試驗 將白頭翁干燥根于微型植物粉碎機中粉碎，過50目篩，準(zhǔn)確稱取5.0 g，若干份，分別加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，配制成不同料液比（g∶mL，下同）的樣品溶液，在一定的微波功率下提取一定的時間，趁熱抽濾，4 000 r/min離心10 min，取上清液入高效液相色譜儀，將得到的峰面積代入回歸方程，依下式計算白頭翁皂苷B4提取率，重復(fù)操作3次取平均值，考察不同因素對白頭翁皂苷提取率的影響。

式中，Y為提取率，%；C為目的成分的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為原料重量，g。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 綜合單因素試驗的分析結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率及微波時間為考察因素，以白頭翁皂苷提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken設(shè)計試驗，見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為Y=2 586.4X-26.734，R2=0.999 6，白頭翁皂苷在0.025～0.600 mg/mL。

2.2 單因素試驗結(jié)果

單因素試驗結(jié)果見圖1。初步選定過50目的白頭翁粉末，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶8、微波功率300 W、微波時間4 min為最佳提取條件，采用響應(yīng)面法對微波輔助提取白頭翁皂苷的條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 通過軟件Design expert 7.0對試驗設(shè)計及結(jié)果（表2）中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得到白頭翁皂苷提取率與各個影響因素之間的關(guān)系模型為：

Y=5.150-0.021A-0.100B+0.081C-0.031AB-0.410AC+0.490BC-0.500A2-0.620B2-0.160C2

在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，對一次項系數(shù)進(jìn)行分析可知，各因素影響順序為：乙醇體積分?jǐn)?shù)<微波時間<微波功率。對模型的各項因素數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，具體結(jié)果見表3。由表3可知，整個響應(yīng)面的回歸方程模型的P值小于0.01，呈極顯著水平，而失擬項F=2.14，P=0.238 1，二者均大于0.05可知，失擬項不顯著，且試驗誤差小，說明這是一項擬合度較高的回歸模型；此外，該模型R2=0.967 5，模型校對系數(shù)R2adj=0.925 8，表明模型可以解釋92.58%的響應(yīng)值變化范圍，因此，該模型可以對微波輔助溶劑法提取白頭翁皂苷效果進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.3.2 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面圖形是反映響應(yīng)值與各個試驗因素之間變化的三維圖形，可從中分析出參數(shù)與最佳參數(shù)間的相互作用關(guān)系[13，14]?；诙位貧w模型進(jìn)行響應(yīng)面繪圖，分別給出了各因素間交互影響顯著的響應(yīng)面圖（圖2）。3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波時間3個因素與白頭翁皂苷的提取率呈拋物線關(guān)系，各因素對白頭翁皂苷提取效果的影響較為顯著，且在考察范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極高值。乙醇體積分?jǐn)?shù)在45%～55%，微波功率在250～350 W，微波時間在3～5 min的范圍內(nèi)有較大的響應(yīng)值。運用 Design expert 7.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得出皂苷提取率最大時乙醇體積分?jǐn)?shù)48.7%、微波功率295.8 W、微波時間4.25 min，考慮到操作的簡便及實際情況，選擇最優(yōu)條件為微波時間4 min、微波功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)試驗，得出實際提取率為5.33%。因此，在實際應(yīng)用提取時，可利用本研究響應(yīng)面法優(yōu)化后的提取條件，該參數(shù)可靠、準(zhǔn)確、實用。

3 結(jié)論

微波輔助溶劑提取法進(jìn)行了單因素試驗研究，考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波時間等因素對白頭翁皂苷提取率的影響，發(fā)現(xiàn)微波功率、微波時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響較為顯著，因此，利用Design expert 7.0軟件的響應(yīng)面設(shè)計對主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，得出各因素的影響順序：微波功率>微波時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)，確定最佳微波提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率300 W、微波時間4 min，此條件下白頭翁皂苷提取率達(dá)到5.33%。

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