韓志霞+馬金玉+王雪云+蔣大偉+劉芳+許蘭菊+李克宇

摘要：為使IpaC基因表達(dá)產(chǎn)物保持天然的生物學(xué)活性，實(shí)現(xiàn)在酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，本研究在不改變IpaC蛋白氨基酸序列的情況下，根據(jù)酵母密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化合成IpaC#基因，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，然后將線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)，僅在pGAPZαA-IpaC#/X-33重組菌表達(dá)產(chǎn)物菌體沉淀中檢測(cè)到大小為70 ku的目的蛋白，實(shí)現(xiàn)了雞源志賀菌IpaC# 基因在畢赤酵母中的胞內(nèi)表達(dá)，從而驗(yàn)證畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與外源基因序列的相關(guān)性，為進(jìn)一步提高雞源志賀菌IpaC基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)研究該病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：雞源志賀菌；IpaC基因；畢赤酵母；優(yōu)化密碼子；pGAPZαA；真核表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q786；S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0039-04

志賀菌可以感染多種物種，不僅是人，志賀菌還可以引起豬、鼠、狐貍、兔、牛等多種動(dòng)物痢疾，其中以幼年動(dòng)物患病率最高，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡[1]。在志賀菌侵襲腸道過(guò)程中，毒力大質(zhì)粒上Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的IpaC蛋白通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞骨架重排而使志賀菌趁機(jī)侵入腸上皮細(xì)胞，而且只有重組純化的IpaC蛋白才能夠在一定程度上恢復(fù)志賀菌的侵襲能力[2]。在分子水平上，IpaC蛋白不同結(jié)構(gòu)域具有不同生物學(xué)功能[3-5]。志賀菌對(duì)人的侵襲感染機(jī)制的研究比較深入。雞源志賀菌擁有與人源菌株相同的IpaC蛋白分子[6-8]，但是至今尚不清楚雞腸上皮細(xì)胞是否存在與人腸上皮細(xì)胞相似的IpaC蛋白受體分子。目前，雞源志賀菌IpaC基因的克隆表達(dá)在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)技術(shù)已經(jīng)比較成熟[9-11]，但目前國(guó)內(nèi)外在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的研究較少。因此，為使IpaC基因表達(dá)產(chǎn)物保持天然的生物學(xué)活性，為研究雞腸上皮細(xì)胞上的IpaC蛋白受體分子提供研究基礎(chǔ)，本研究通過(guò)根據(jù)酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏愛(ài)性，對(duì)雞源志賀菌IpaC基因進(jìn)行優(yōu)化合成，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，使IpaC和IpaC#整合到酵母染色體中，從而驗(yàn)證畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與外源基因序列的相關(guān)性，為進(jìn)一步提高雞源志賀菌IpaC基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)研究該病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

1材料與方法

1.1菌株及載體

原核重組載體pET32a-IpaC/BL21為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；酵母真核載體pGAPZαA由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)尹清強(qiáng)教授惠贈(zèng)；宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli） TOP10購(gòu)自上海北諾生物技術(shù)有限公司；畢赤酵母菌株X-33為河南科技大學(xué)張春杰教授惠贈(zèng)。

1.2酶與試劑

rTaq DNA聚合酶、DL2000、DL5000均購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ均購(gòu)自Fermentas公司（美國(guó)）；T4連接酶購(gòu)自于New England Biolabs（英國(guó)）公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物合成和重組質(zhì)粒的測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。蛋白胨、酵母膏、Agar power均購(gòu)自O(shè)XIOD公司；瓊脂糖凝膠購(gòu)自GENVIEW公司；ZeocinTM購(gòu)自invitrogen公司；鼠源 6-His單克隆抗體（Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody），購(gòu)自美國(guó)Abbkine試劑公司；羊抗小鼠IgG-HRP，購(gòu)自索萊寶公司；IpaC蛋白免疫血清及雞源志賀菌滅活疫苗免疫血清均由筆者實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3IpaC#基因序列的合成

根據(jù)酵母密碼子偏愛(ài)性，在不改變氨基酸序列的情況下，對(duì)IpaC基因原序列進(jìn)行優(yōu)化，由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司合成，并將基因序列克隆到pUCE載體上，命名為pUCE-IpaC#。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)雞源志賀菌IpaC基因與IpaC#基因全序列及畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA多克隆位點(diǎn)序列分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物P1、P2和P3、P4，上游引物加上EcoRⅠ、下游引物加上XbaⅠ這2個(gè)酶切位點(diǎn)（斜體加粗為酶切位點(diǎn)），并根據(jù)載體pGAPZαA序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物P5、P6，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，已經(jīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)。序列如下：

1.5重組載體構(gòu)建

分別以pET32a-IpaC和pUCE-IpaC#為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切下目的條帶，用普通瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段?；厥债a(chǎn)物和質(zhì)粒pGAPZαA用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶同時(shí)進(jìn)行雙酶切并經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，分別將IpaC和IpaC#基因雙酶切產(chǎn)物與載體pGAPZαA雙酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TOP10，在含ZeocinTM抗性平板上進(jìn)行篩選。挑取陽(yáng)性單克隆，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切鑒定和序列分析。獲得的重組質(zhì)粒命名為pGAPZαA-IpaC、pGAPZαA-IpaC#。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母宿主菌X-33

大量提取質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ進(jìn)行單酶切線性化，電泳后用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，分別電轉(zhuǎn)化至酵母菌X-33感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)條件為：1.6 kV，25 μF，400 Ω，電擊時(shí)間43 ms。電擊完畢后，馬上將1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液加入菌體中，吹打混勻，轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，30 ℃靜置培養(yǎng)1～2 h。取100 μL菌體懸液涂布于含有抗生素Zeocin濃度為100 μg/mL的YPD固體培養(yǎng)基上，待菌液完全吸收后，將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，直至單菌落出現(xiàn)，同時(shí)電轉(zhuǎn)空質(zhì)粒pGAPZαA作對(duì)照。

1.7高抗篩選

挑取在ZeocinTM濃度為100 μg/mL平板上的單菌落，分別刺種在ZeocinTM濃度為500、1 000、2 000 μg/mL的YPD平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，直至有單菌落出現(xiàn)。將高抗性陽(yáng)性克隆接種于Zeocin濃度為100 μg/mL的YPD平板上培養(yǎng)2～3 d，直至有單菌落出現(xiàn)。將高抗陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子按照酵母基因組DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取酵母基因組DNA，利用檢測(cè)引物P5、P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)

挑取鑒定正確的重組酵母單菌落接種于液體YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取0.2 mL過(guò)夜培養(yǎng)物接種于100 mL液體YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min 下振蕩培養(yǎng)。分別在0、24、32、48、60、72、84、96、108、120、144 h的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集上清和細(xì)胞樣品10 mL，用于SDS-PAGE及Western blot分析，同時(shí)設(shè)立pGAPZαA/X-33表達(dá)為對(duì)照組。將各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集的菌液在4 ℃離心機(jī)中，于5 000 r/min下離心5 min，分別取菌體沉淀和上清。沉淀轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的EP管中。將收集的培養(yǎng)基上清用超濾法濃縮后進(jìn)行SDS及Western blot檢測(cè)。Western blot分別用His單抗、IpaC蛋白免疫血清及雞源志賀菌滅活疫苗免疫血清進(jìn)行特異性檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.2重組載體的鑒定結(jié)果

挑取轉(zhuǎn)化后平板上的單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，各取1 μL作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，電泳出現(xiàn)1條約1 107 bp的特異性條帶，與目的基因片段大小一致（圖1-A）。提取的質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC#和pGAPZαA-IpaC經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切電泳出現(xiàn)2條帶，其中1條條帶為載體質(zhì)粒，約3 084 bp，另1條條帶片段長(zhǎng)約1 097 bp，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致（圖1-B）。對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果分析，結(jié)果表明IpaC基因及IpaC#基因均位于pGAPZαA質(zhì)粒α因子信號(hào)肽序列下游，具有正確的閱讀框。

2.3高抗性陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定

以轉(zhuǎn)化有線性化的重組質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#的酵母基因組為模板，以α-Factor sequencing primer和3′ AOX1 sequencing primer為引物進(jìn)行PCR，若線性化的含目的基因的重組質(zhì)粒與酵母成功重組則應(yīng)擴(kuò)增出[FL）]

長(zhǎng)度為1 333 bp的片段，線性化的質(zhì)粒pGAPZαA與酵母成功重組則應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為299 bp的小片段，pGAPZαA-IpaC為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，結(jié)果（圖2）與預(yù)期一致，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，線性化的重組質(zhì)粒已經(jīng)成功整合到酵母基因組中。

2.4重組酵母表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果

分別挑取pGAPZαA-IpaC/X-33和pGAPZαA-IpaC#/X-33陽(yáng)性酵母菌培養(yǎng)表達(dá)，不同時(shí)間取的樣品中上清和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色，與空載體對(duì)照菌比較X-33菌體沉淀樣品用帶His單抗作Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖4-A所示，菌體沉淀中蛋白大小位置與預(yù)期一致，在108 h時(shí)表達(dá)量最高。將84、96、108、120、144 h取得的樣品用IpaC蛋白免疫后血清抗體作Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖4-B所示，蛋白大小位置與預(yù)期一致。將84、96、108、120、144 h取得的樣品用志賀菌全菌體疫苗菌免疫的血清抗體作Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖4-C所示，蛋白大小位置與預(yù)期一致。

3結(jié)論與討論

真核表達(dá)系統(tǒng)克服了原核表達(dá)系統(tǒng)持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難的缺點(diǎn)，而真核表達(dá)系統(tǒng)能誘導(dǎo)基因的高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及，可以嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，人為地調(diào)控基因表達(dá)量。因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)目的蛋白越來(lái)越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。[FL）]

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可使外源對(duì)蛋白進(jìn)行加工修飾，使得表達(dá)的外源蛋白具有類(lèi)似天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象[12]。而本研究選擇的真核表達(dá)載體pGAPZαA以GAP為啟動(dòng)子，在表達(dá)過(guò)程中不須要添加甲醇，操作更為簡(jiǎn)單，其含有α信號(hào)因子，利用該信號(hào)因子可將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中獲得純度較高的蛋白[13-14]。

影響外源基因在畢赤酵母中表達(dá)量的因素很多，其中外源基因自身的特點(diǎn)是影響表達(dá)量的重要因素，包括密碼子使用情況、GC含量等。國(guó)內(nèi)外很多研究通過(guò)將外源基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使外源基因的密碼子使用頻率符合畢赤酵母的密碼子偏好性的要求，取得很好的效果[15-18]。本研究通過(guò)對(duì)IpaC基因的分析發(fā)現(xiàn)，該基因中含有畢赤酵母的稀有密碼子，基于這種情況，本研究根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，對(duì)雞源志賀氏菌來(lái)源的IpaC基因進(jìn)行優(yōu)化改造，在不改變其氨基酸序列的基礎(chǔ)上，選擇畢赤酵母偏愛(ài)型的密碼子，并調(diào)整基因的GC含量，使其更加符合畢赤酵母的要求。優(yōu)化后的IpaC#基因與原始IpaC基因序列相比，共改變了269個(gè)堿基，涉及207個(gè)氨基酸，GC含量由原來(lái)的38.83%變?yōu)?40.02%，而在畢赤酵母中GC含量一般為40%～42%，優(yōu)化合成的目的基因GC含量與畢赤酵母相符。

本研究分別構(gòu)建了真核表達(dá)載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，重組菌的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)，在pGAPZαA-IpaC重組菌菌體沉淀和表達(dá)上清中均沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白，而在pGAPZαA-IpaC#重組菌菌體沉淀中檢測(cè)到目的蛋白大小約為70 ku，這進(jìn)一步驗(yàn)證了畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)與外源基因本身有關(guān)[19-20]。而在pGAPZαA-IpaC#重組菌表達(dá)培養(yǎng)基上清中并未檢測(cè)到目的蛋白，有可能是因?yàn)镮paC蛋白本身具有膜結(jié)合區(qū)，在分泌過(guò)程中與酵母細(xì)胞發(fā)生結(jié)合，也有可能是α信號(hào)肽與IpaC基因在一定程度上不匹配，為后期進(jìn)一步研究IpaC蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)試驗(yàn)中，更換信號(hào)肽序列或者優(yōu)化信號(hào)肽序列密碼子可能使IpaC蛋白高效分泌表達(dá)。

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