蒲鵬+謝曉東+白子彧+郭雨+古同華+李明+王俊斌+孫守鈞+丁博

摘要：啟動子決定了基因的組織器官表達(dá)特異性及其在環(huán)境、內(nèi)源激素作用下的誘導(dǎo)型表達(dá)，因此對啟動子的分析有利于解析基因的表達(dá)模式及功能。對玉米Ubiquitin啟動子控制的nptII抗性基因添加適宜的酶切位點，連接到pGWB433雙元載體中，構(gòu)建目標(biāo)表達(dá)載體p14781pro-GUS。該載體具有適于在禾谷類作物中篩選轉(zhuǎn)基因植株的Ubiquitin-nptII組件、啟動子高效克隆的Gateway組件，且整合進(jìn)載體的啟動子可控制報告基因GUS的表達(dá)，以確定啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，因而能夠更加深入便捷地研究禾谷類作物重要性狀相關(guān)基因的啟動子，推動針對重要性狀的分子遺傳改良。

關(guān)鍵詞：啟動子；載體構(gòu)建；p14781pro-GUS；GUS蛋白；限制性內(nèi)切酶

中圖分類號： Q782文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0060-03

目前，應(yīng)用于雙子葉轉(zhuǎn)基因體系中啟動子分析的載體非常豐富，如pGWB系列載體，研究也已非常完備。而單子葉植物轉(zhuǎn)基因體系的研究盡管已取得很好進(jìn)展，但適于單子葉特別是禾谷類作物啟動子研究的載體卻非常有限。

在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動子是組成型啟動子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV 35S啟動子，禾谷類轉(zhuǎn)基因植物主要使用來自玉米的Ubiquitin啟動子[1]和來自水稻的Actin I啟動子[2]。在這些組成型表達(dá)啟動子的控制下，外源基因可在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有發(fā)育階段表達(dá)[3]。

Ubiquitin 啟動子是一個在禾谷類作物中有較強表達(dá)的啟動子，Ubiquitin啟動子來自玉米多聚泛素蛋白基因（maize polyubi gene），它實際上包括Ubiquitin基因的啟動子區(qū)、5′非翻譯區(qū)和第一內(nèi)含子。研究表明，Ubiquitin啟動子在禾谷類作物中能組成型過量表達(dá)，表達(dá)效率高于35 S啟動子[4]。

GUS的基因gusA（又稱uidA）來自大腸桿菌菌株K12。Novel等研究并克隆了含有uidA基因的DNA片段，對其調(diào)控部分進(jìn)行了分析[5-7]。Jefferson等進(jìn)行了uidA基因的序列分析，該基因編碼區(qū)長1 809 bp，并由此發(fā)展了uidA基因作為一個基因融合標(biāo)記，使其得到了更廣泛的應(yīng)用[8]。該酶與5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽（X-Gluc）底物發(fā)生藍(lán)色沉淀反應(yīng)，檢測容易、高效、方法多樣，且靈敏度高于GFP檢測[9]。GUS基因作為基因融合的標(biāo)記，最初應(yīng)用于大腸桿菌。后來發(fā)現(xiàn)幾乎所有的高等植物，特別是已研究的煙草、矮牽牛及擬南芥等，都很少或幾乎沒有GUS活性[10]，因此GUS基因被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物中的報告基因。

相對于傳統(tǒng)的使用限制性內(nèi)切酶構(gòu)建表達(dá)載體，由 Invitrogen 公司開發(fā)的Gateway克隆技術(shù)得到廣大研究者的認(rèn)同和青睞。該技術(shù)基于K噬菌體位點特異性重組原理[11]，其優(yōu)點在于可以在不同的克隆載體之間實現(xiàn)DNA 片段的轉(zhuǎn)移，并保持基因定位和閱讀框架不發(fā)生改變。對于研究者來說，這項技術(shù)是進(jìn)行載體構(gòu)建的入門技術(shù)，簡便易行。

本研究擬通過構(gòu)建表達(dá)載體p14781pro-GUS，建立適用于禾谷類作物高效啟動子功能分析的載體系統(tǒng)和評價體系。應(yīng)用本載體，可通過Gateway克隆技術(shù)高效克隆目標(biāo)啟動子序列，由于Ubiquitin啟動子和nptII抗性基因的結(jié)合，易于對禾谷類作物轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行篩選鑒定。此外，利用GUS報告基因的表達(dá)水平來衡量啟動子的功能，也方便了啟動子功能的鑒定。對禾谷類作物重要性狀相關(guān)基因進(jìn)行啟動子研究，對推動針對重要性狀的分子遺傳改良有重要的理論和應(yīng)用意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

質(zhì)粒pGWB433、pEASY-ubi-npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]均為筆者實驗室保存，ubi代表Ubiquitin啟動子序列，npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]代表新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Neomycin Phosphotransferase Ⅱ，NPTⅡ）。

大腸桿菌菌株（E.coli）DH5α、DB3.1感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2試劑和生物學(xué)軟件

Phusion超保真DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司，pGEM-T Easy 載體購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒和特異性引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，生物信息學(xué)研究所用軟件為Geneious 8、Vector NTI Advanced 11。

進(jìn)行TA克隆反應(yīng)，將回收產(chǎn)物連接到載體pGEM-T easy上，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆，搖菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒收集質(zhì)粒pGUN。

1.3.2ubi-npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]片段與pGWB433載體的組裝將pGWB433和pGUN進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。酶切先用SacⅡ在37 ℃反應(yīng)30 min，再加入1 μL AscI 37 ℃反應(yīng)40 min，電泳檢測。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，產(chǎn)物通過T4 DNA連接酶連接，連接體系于25 ℃反應(yīng)1 h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DB3.1感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR驗證轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物，挑取驗證正確的克隆進(jìn)行測序（北京六合華大基因科技股份有限公司），具體的載體構(gòu)建思路見圖1。

2結(jié)果與分析

2.1pGUN載體的構(gòu)建

為了進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，首先設(shè)計合成了包含AscⅠ、SacⅡ位點的1對引物，得到了pGUN載體。

2.2p14781pro-GUS載體構(gòu)建

AscI對質(zhì)粒pGWB433和pGUN進(jìn)行單酶切，SacII對酶切之后的片段再次酶切，結(jié)果見圖2。取SacII/AscI酶切回收后的片段，按照大約1 ∶[KG-*3]1的分子比在T4 DNA連接酶催化下進(jìn)行定向重組，菌落PCR結(jié)果見圖3。把菌落PCR篩選出的質(zhì)粒進(jìn)行測序，做進(jìn)一步驗證，測序結(jié)果正確（測序圖未顯示），p14781pro-GUS載體見圖4。

3討論

啟動子決定了基因的表達(dá)模式，包括在組織器官的表達(dá)特異性和在誘導(dǎo)物作用下的誘導(dǎo)型表達(dá)，因此對啟動子功能分析有利于解析基因的生物學(xué)功能。外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效地表達(dá)不但造成能量浪費，往往還會引起植物的形態(tài)和生長發(fā)育的改變。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時又可減少對植物的不利影響，目前人們對誘導(dǎo)型及特異表達(dá)型啟動子的研究和應(yīng)用越來越重視，而作物與糧食安全和人類生活質(zhì)量密切相關(guān)，對禾谷類作物啟動子的研究與特異性啟動子的篩選越來越重要。

本研究選用Ubiquitin啟動子調(diào)控抗性基因的表達(dá)，與已有的表達(dá)載體多采用CaMV 35S啟動子相比，抗性基因的表達(dá)水平可明顯提高[4]，對于遺傳轉(zhuǎn)化效率普遍較低的禾谷類作物，能更有效地篩選出陽性植株，輔助PCR進(jìn)行篩選陽性植株會提高篩選效率[12]。

該載體對啟動子分析的元件為gusA基因，與此前筆者實驗室構(gòu)建的pUKGF載體同為研究禾谷類作物啟動子功能的表達(dá)載體[13]。在應(yīng)用中將2個載體進(jìn)行比較可知：pUKGF可對活體植物進(jìn)行連續(xù)活體觀察，觀測手段簡單，但對具有自發(fā)熒光的組織就無法準(zhǔn)確進(jìn)行此類分析。Jordan觀測到在1株轉(zhuǎn)基因小麥的不同胚中GFP強度有明顯差異[14]；p14781pro-GUS則需要經(jīng)過X-Gluc組織化學(xué)染色，步驟較熒光觀測繁瑣，且為破壞性試驗，植物不可繼續(xù)生長發(fā)育，但對GUS酶的放大作用與植物自身無GUS活性，檢測效果靈敏，肉眼即可觀測結(jié)果，因此應(yīng)用范圍更廣泛[9]。在觀測根系等組織特異表達(dá)的啟動子效率時可采用p14781pro-GUS載體。筆者所在研究組已經(jīng)成功采取GUS染色評價表達(dá)載體pKIGW在擬南芥中的應(yīng)用效果[15]。

近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化禾谷類作物的成功，為進(jìn)行基因功能分析奠定了基礎(chǔ)[16-17]。本研究中構(gòu)建的pUKGS載體可以利用Gateway技術(shù)克隆目的片段，分析啟動子功能的載體的核心元件為attR1-Cmr-ccdB-attR2-tag-terminator，該表達(dá)載體即可用于下游植物遺傳工程中的“后基因組研究”[18]，大大提高了克隆效率，可作為禾谷類作物遺傳轉(zhuǎn)化中的首選。

該載體系統(tǒng)所選擇的質(zhì)粒重組技術(shù)、報告基因、抗性標(biāo)記基因，均是目前國際、國內(nèi)植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域應(yīng)用最多的元件，尤其是由Ubiquitin啟動子調(diào)控抗性標(biāo)記基因，能在禾谷類作物的陽性植株篩選上發(fā)揮獨特作用。

[HS2*3][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：

[1]王昌濤，梁粵，王歡，等. 玉米Ubiquitin啟動子的克隆及功能鑒定[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（1）：9-12.

[2]McElroy D，Zhang W，Cao J，et al. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation[J]. The Plant Cell，1990，2（2）：163-171.

[3]侯丙凱，夏光敏，陳正華. 植物基因工程表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化策略[J]. 遺傳，2001，23（5）：492-497.

[4]Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[5]Novel G，Didier-Fichet M L，Stoeber F. Inducibility of β-glucuronidase in wild-type and hexuronate-negative mutants of Escherichia coli K-12[J]. Journal of Bacteriology，1974，120（1）：89-95.

[6]Novel M，Novel G. Regulation of β-glucuronidase synthesis in Escherichia coli K-12：constitutive mutants specifically derepressed for uidA expression[J]. Journal of Bacteriology，1976，127（1）：406-417.

[7]Blanco C，Ritzenthaler P，Mata-Gilsinger M. Nucleotide sequence of a regulatory region of the uidA gene in Escherichia coli K12[J]. Molecular and General Genetics，1985，199（1）：101-105.

[8]Jefferson R A，Burgess S M，Hirsh D. β-glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1986，83（22）：8447-8451.

[9]袁思瑋，黃銳之，羅紅兵. GUS報告基因在植物功能基因研究中的應(yīng)用[J]. 作物研究，2008，22（5）：310-314.[ZK）]

[10]Jefferson R A，Kavanagh T A，Bevan M W. GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. The EMBO Journal，1987，6（13）：3901.

[11]Landy A. Dynamic，structural，and regulatory aspects of lambda site-specific recombination[J]. Annual Review of Biochemistry，1989，58（1）：913-941.

[12]Yau Y Y，Stewart C N. Less is more：strategies to remove marker genes from transgenic plants[J]. BMC Biotechnology，2013，13（1）：1.

[13]丁博，楊文麗，李明，等. 用于單子葉植物啟動子功能分析的pUKGF載體構(gòu)建[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（2）：15-18.

[14]Jordan M C. Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation[J]. Plant Cell Reports，2000，19（11）：1069-1075.

[15]丁博，鐘思林，王俊斌，等. 化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)載體pKIGW在擬南芥中的應(yīng)用[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（10）：11-13.

[16]張瑩瑩，吳連成，張賽賽，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化影響因子和植株再生條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：51-54.

[17]劉青，李朝煒，朱昀，等. 抗逆轉(zhuǎn)基因旱稻轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：42-45.

[18]Nakagawa T，Ishiguro S，Kimura T. Gateway vectors for plant transformation[J]. Plant Biotechnology，2009，26（3）：275-284.