曹劍鋒??+任朝輝??+蘆靜波??+王自布??+夏慧芳??+夏麗莎??+劉丹

摘要：水提醇沉法提取百尾參多糖，以多糖得率為指標(biāo)，考察提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)對多糖提取量的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝參數(shù)。通過測定百尾參多糖清除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH自由基能力、還原力及螯合力來評價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，百尾參多糖水提取的最佳工藝條件為提取溫度100 ℃、提取時(shí)間4 h、料液比1 g ∶[KG-3]50 mL、提取次數(shù)4次，在此條件下，百尾參多糖的提取率為15.68%，以正交試驗(yàn)極差分析得出，溫度對百尾參粗多糖提取影響最大。百尾參多糖清除DPPH自由基和·OH自由基、還原力及螯合力的IC50值分別是4.8、1.8、3.9、0.24 mg/mL，百尾參多糖具有顯著體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：百尾參；多糖；提取；抗氧化

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0343-04

百尾參為百合科（Liliaceae）萬壽竹屬（Disporum）植物萬壽竹[Disporum cantoniense（Lour.）Merr.]的根及根莖，別稱白味參、白龍須等。百尾參為多年生草本藥用植物，在中國南北均有分布，具有潤肺止咳、健脾消積的功效，傳統(tǒng)用于虛損咳喘、痰中帶血、腸風(fēng)下血、食積脹滿等癥狀[1-2]。以百尾參為主藥的市售復(fù)方制劑有貴州百靈生產(chǎn)的咳速停系列藥物。陳磊等對其化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，百尾參含有多種活性成分，如黃酮類化合物以及糖苷類化合物、萜類以及揮發(fā)油、有機(jī)酸等[3-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，百尾參具有止咳、抗菌、抗炎等多種藥理作用[7-8]；關(guān)于百尾參多糖提取的工藝研究未見報(bào)道。本研究以百尾參為原料，水提醇沉法提取多糖。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以正交試驗(yàn)對百尾參多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過測定百尾參多糖清除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH自由基能、還原力及螯合力來評價(jià)其抗氧化活性。為百尾參多糖在食品及相關(guān)領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

百尾參藥材采自貴州省安順市，經(jīng)貴州師范學(xué)院鑒定為百合科（Liliaceae）萬壽竹屬（Disporum）植物萬壽竹[Disporum cantoniense（Lour.）Merr.]；ferrozine，DPPH，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；95%乙醇溶液、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、氯化亞鐵、葡萄糖、磷酸氫鉀、維生素C等均為國產(chǎn)分析純。

恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司生產(chǎn)；真空抽濾機(jī)，鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；電子天平，上海精密科技儀器有限公司生產(chǎn)；凍干機(jī)，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；分光光度計(jì)，上海精密科技儀器有限公司生產(chǎn)；離心機(jī)，江蘇正基儀器有限公司生產(chǎn)；干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1水提醇沉提取工藝

百尾參干粉→蒸餾水浸提 →4 000 r/min 離心10 min→上清→減壓濃縮至原體積10%→4倍體積乙醇醇沉→3 500 r/min離心10 min→沉淀物→洗滌→百尾參粗多糖。

1.2.2多糖得率測定與計(jì)算

多糖含量以苯酚-硫酸法測定[9]。以干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖配制標(biāo)準(zhǔn)液，于490 nm波長處測得的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算多糖得率：

[JZ]提取率=[SX（]比色液濃度（μg/mL）×稀釋倍數(shù)×250〖〗供試樣品質(zhì)量（g）×106[SX）]×100%。

1.2.3單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照楊林等的方法[10]設(shè)置單因素試驗(yàn)：考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對多糖提取率的影響。并對多糖提取率進(jìn)行計(jì)算，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以百尾參多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，提取溫度（A），提取時(shí)間（B），料液比（C）、提取次數(shù)（D）為試驗(yàn)因素，在4因素3水平上對百尾參多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

1.2.4多糖純化

將百尾參粗多糖以活性炭脫色、saveage法脫蛋白，經(jīng)醇沉后透析、冷凍干燥[11-12]；即得到純化后的熱水浸提的多糖。此純化的多糖用于后續(xù)抗氧化活性評價(jià)試驗(yàn)。

1.2.5多糖的抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH 清除活性測定

參照韋獻(xiàn)雅等的方法[13-14]，稍有改動，用95%乙醇配制濃度為2×10-4 mol/L的 DPPH溶液。取“1.2.4”節(jié)制備的多糖樣品配制40、80、160、320、640、1 280、2 000 μg/mL百尾參糖溶液，在8支試管中分別加入各質(zhì)量濃度的樣品糖溶液和蒸餾水2 mL，精確加入2 mL DPPH溶液，混勻30 min后517 nm測定吸光值，以維生素C為對照，每份樣品平行操作3 次，根據(jù)公式（1）計(jì)算DPPH清除率：

[JZ（]DPPH清除率=（D0-D樣品）/D0×100%。[JZ）][JY]（1）

式中：D0為2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混合后的吸光度；D樣品為2 mL DPPH乙醇溶液與樣品混合后的吸光度。

1.2.5.2清除·OH能力的測定

參照葛霞等、吳向陽等的方法[15-16]，取“1.2.4”節(jié)制備的多糖樣品配制80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL的糖樣品溶液，在8支10 mL的試管中分別加入3 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，3 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，0.05%的H2O2溶液1 mL，立即混勻，再分別加入各質(zhì)量濃度樣品糖溶液1 mL，蒸餾水管為空白對照。37 ℃反應(yīng)30 min后510 nm測量吸光度。以維生素C為對照，每份樣品平行操作3 次，根據(jù)公式（2）計(jì)算·OH清除率：

[JZ（]清除率=（D0-D樣品）/D0×100%。[JZ）][JY]（2）

式中：D0為空白對照液的吸光值；D樣品為加入不同濃度糖溶液的吸光值。

1.2.5.3Fe2+螯合能力的測定

參照文獻(xiàn)[17]的方法將 “12.4”節(jié)制備的多糖樣品配制成80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL的溶液，在9支試管中分別再加入3.7 mL 蒸餾水，0.1 mL 2 mmol的FeCl2溶液，分別加入各質(zhì)量濃度樣品液1 mL，混合均勻后加入0.2 mL 5 mmol/L的ferrozine啟動反應(yīng)，空白管為不加糖液蒸餾水管，標(biāo)準(zhǔn)管用蒸餾水代替FeCl2溶液，室溫放置30 min后562 nm處測定吸光度，以EDTA 做對照，每份樣品平行操作3 次。根據(jù)公式（3）計(jì)算金屬螯合能力（%）：

[JZ（]金屬螯合能力=[D0-（D樣品-D標(biāo)準(zhǔn)）]/D0×100%。[JZ）][JY]（3）

式中：D0為空白對照的吸光值；D樣品為加入不同濃度糖溶液的吸光值；D標(biāo)準(zhǔn)為蒸餾水代替FeCl2溶液的吸光值。

1.2.5.4總還原能力的測定

參照文獻(xiàn)[18]的方法加以適當(dāng)改進(jìn)，在8支試管中分別加入0、80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL “1.2.4”節(jié)制備的多糖樣品溶液0.2 mL，再加入0.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值6.6）和0.5 mL 1%鐵氰化鉀?；靹蚝笤?0 ℃放置20 min，加入0.5 mL 10%三氯乙酸后3 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL，加入1 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻后在700 nm波長下測定吸光度D。以維生素C為對照。平行測定3次。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與對應(yīng)的吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性方程為y=0.016 11x，r2=0.9992，可根據(jù)方程計(jì)算多糖得率。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1料液比對粗多糖提取率的影響從圖1可以看出，開始隨著料液比的增加，多糖的得率隨之增加，當(dāng)料液比為1 g ∶[KG-3]60 mL 時(shí)多糖得率達(dá)到最高，隨后隨著料液比的繼續(xù)增加，多糖提取得率并沒有明顯增加，并稍呈下降趨勢。

2.2.2溫度對粗多糖提取率的影響從圖2可以看出，起初隨著溫度的升高，百尾參多糖的得率相應(yīng)增加。當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)多糖提取率達(dá)到最高，到100 ℃時(shí)則稍有降低。

2.2.3時(shí)間對粗多糖提取率的影響從圖3可以看出，隨著時(shí)間延長，百尾參多糖的得率增加，3.0 h達(dá)到最高值，當(dāng)提取時(shí)間大于3.0 h時(shí)，多糖的得率有所下降。

2.4.2DPPH自由基清除能力從圖6可以看出，百尾參多糖對DPPH自由基具有一定的清除作用，其清除能力隨樣品質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)（半數(shù)抑制濃度IC50為8.4 mg/mL），相比之下百尾參多糖對DPPH自由基的清除作用較維生素C弱。

2.4.3百尾參多糖的金屬螯合力從圖7可以看出，百尾參多糖在較小濃度時(shí)隨著質(zhì)量濃度增加對金屬的螯合力迅速升高，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0 .32 mg/mL時(shí)，對金屬螯合力達(dá)80%以上，顯示了較強(qiáng)的螯合金屬離子或惰化金屬離子的能力，IC50值為0.24 mg/mL。

2.4.4百尾參多糖的還原能力從圖8可以看出，維生素C的吸光度隨著質(zhì)量濃度的增加明顯上升，與維生素C的吸光度相比白尾參多糖隨濃度增加吸光度增加緩慢，但呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，表明還原能力逐漸增強(qiáng)，抗氧化能力也增強(qiáng)。IC50為3.9 mg/mL。

3結(jié)論

通過正交設(shè)計(jì)得出百尾參多糖的最佳工藝條件為：提取溫度100 ℃，提取時(shí)間4 h，提取次數(shù)4次，料液比 1 g ∶[KG-3]50 mL，在此條件下多糖得率15.68%，該優(yōu)化結(jié)果對百尾參多糖開發(fā)利用和生產(chǎn)有重要的參考價(jià)值。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，百尾參多糖對羥自由基和DPPH自由基都有一定的清除能力，且具有一定的還原力和較強(qiáng)的金屬螯合能力，表明百尾參多糖具有較好的抗氧化活性。因而百尾參多糖在天然抗氧化劑和功能食品的開發(fā)方面都有良好的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]邱德文，杜江. 中華本草（苗藥卷）[M]. 貴陽：貴州科技出版社，2005：54-55.

[2]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材：民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M]. 2003年版. 貴陽：貴州科技出版社，2003：162.

[3]吳文利，張雁萍，王道平，等. 野生和人工栽培百尾參揮發(fā)油GC-MS分析[J]. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，36（3）：255-258.

[4]甘秀海，趙超，梁志遠(yuǎn)，等. 百尾參化學(xué)成分研究[J]. 貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，32（1）：64-66.

[5]陳磊. 百合科兩種藥用植物化學(xué)成分及生物活性研究[D]. 天津：天津大學(xué)，2009.

[6]Chen L，Su Y F，Yin Z Y，et al. Flavonoids from Disporum cantoniense（Liliaceae）[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2009，37（5）：609-612.

[7]任朝輝，曹劍鋒，夏麗莎，等. 百尾參祛痰止咳、抗炎作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：116-118.

[8]甘秀海，梁志遠(yuǎn)，王瑞. 百尾參抑菌活性研究[J]. 貴陽學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，7（1）：43-44，52.[HJ1.73mm]

[9]王文平，郭祀遠(yuǎn)，李琳，等. 苯酚-硫酸法測定野木瓜中多糖含量的研究[J]. 食品科學(xué)，2007，28（4）：276-279.[ZK）]

[10]楊林，劉翠花，劉剛，等. 西藏野生尊麻水溶性多糖提取工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（2）：35-37.

[11]Chen Y，Xie M Y，Li W J，et al. An effective method for deproteinization of bioactive polysaccharides extracted from lingzhi（Ganoderma atrum）[J]. Food Science and Biotechnology，2012，21（1）：191-198.

[12]程超，李偉，汪興平. 平菇水溶性多糖結(jié)構(gòu)表征與體外抗氧化作用[J]. 食品科學(xué)，2005，26（8）：55-57.

[13]韋獻(xiàn)雅，殷麗琴，鐘成，等. DPPH法評價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2014，35（9）：317-322.

[14]Li W，Liang H，Zhang M W，et al. Phenolic profiles and antioxidant activity of litchi（Litchi chinensis Sonn.）fruit pericarp from different commercially available cultivars[J]. Molecules，2012，17（12）：14954-14967.

[15]葛霞，陳婷婷，蔡教英，等. 青錢柳多糖抗氧化活性的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2011，11（5）：59-64.

[16]吳向陽，范群艷，仰榴青，等. 匙羹藤粗多糖的提取及其清除羥自由基活性研究[J]. 食品科學(xué)，2008，29（1）：107-110.

[17]楊少輝，宋英今，王清華，等. 雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力[J]. 食品科學(xué)，2010，31（17）：166-169.