戰(zhàn)偉偉，魏曉宇，高本杰，李敬龍*

(1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東濟南250103；2.齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟南250353）

藍靛果椰子復(fù)合酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化

戰(zhàn)偉偉1，魏曉宇2，高本杰2，李敬龍2*

(1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東濟南250103；2.齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟南250353）

以藍靛果和椰子為主要原料，研究復(fù)合酵素原液的發(fā)酵工藝。經(jīng)單因素試驗分析了發(fā)酵溫度、原料配比、菌種比例3個主要因素對復(fù)合酵素的影響，以花色苷含量、超氧化物歧化酶（SOD）酶活力、殘?zhí)橇?、總黃酮含量為考察指標，通過設(shè)計正交試驗確定藍靛果椰子復(fù)合酵素最佳工藝。結(jié)果表明，在發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時間為70 d，酵母菌與雙歧桿菌配比為2:1，藍靛果果漿與椰子果漿質(zhì)量比為5:1的發(fā)酵條件下，得到的藍靛果椰子復(fù)合酵素中花色苷含量為12.17 mg/g，總黃酮含量20.31 mg/g、SOD酶活力為56.74 U/mL、殘?zhí)橇繛?.22 mg/mL，產(chǎn)品酸度適宜，香味突出，口味獨特。

藍靛果；椰子；復(fù)合酵素；發(fā)酵工藝

藍靛果（Lonicera caerulea）屬忍冬科，是一種野生漿果類植物，種子極小，出汁率極高，含有豐富的氨基酸、維生素和生物活性物質(zhì)，有著比藍莓等相似植物更佳優(yōu)越的抗氧化活性，營養(yǎng)保健價值極高。花色苷和黃酮類化合物作為藍靛果果實中的功能成分，具有若干有益的生理功能和藥理作用，其中花色苷具有消除自由基、抗衰老、抗氧化和提高免疫力的功能，黃酮類化合物可促進人體內(nèi)的血液循環(huán)、防治老年人的心血管疾病。

椰子含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素B族及微量元素鉀、鎂等，是一種營養(yǎng)保健的純天然綠色食品。椰子中椰肉占30%，椰子水占25%[1]，椰水子風(fēng)味純正、清涼解渴；椰肉能有效地補充細胞內(nèi)液，滋潤皮膚，有駐顏美容的作用。綜合利用椰子的果實，可充分發(fā)揮椰子的生物功效和經(jīng)濟價值。

酵素技術(shù)是由日本磐亞株式會社的微生物專家島本覺也[2]從柴田欣司氏應(yīng)用微生物生產(chǎn)農(nóng)肥中分離出的3類共24種有益菌，將其按一定比例混合制成酵素菌原菌。經(jīng)島本家族3代人50年的潛心研究，逐步形成了“酵素菌農(nóng)業(yè)應(yīng)用法”[3]。20世紀末以來先后被20多個國家和地區(qū)引進推廣，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于世界許多國家的種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和食品加工業(yè)等領(lǐng)域，

國際上大部分的酵素行業(yè)都在模仿日本酵素企業(yè)的制備方式與用料配比，產(chǎn)品與功能單一，而國內(nèi)對酵素的研究尚處于發(fā)展階段，我國臺灣地區(qū)[4]萬大集團生產(chǎn)的萬大酵素、臺灣鼎杰生物科技有限公司生產(chǎn)的“酵傲人生”牌復(fù)合酵素以及臺灣寶芝林國際生物科技有限公司生產(chǎn)的養(yǎng)命酵素、本草漢方酵素等具有一定的創(chuàng)新性與產(chǎn)品競爭力。雖然日本的酵素制作工藝相對成熟，但因其采用的原料多以蔬菜、藥草為主，其風(fēng)味并不能讓消費者接受，所以果蔬酵素的發(fā)展空間與市場潛力依然巨大。

本研究是利用藍靛果和椰肉椰汁，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，控制發(fā)酵溫度、原料配比、菌種比例等關(guān)鍵參數(shù)，得到具有美白抗氧化、抗菌消炎、潤腸通便、解酒護肝等保健功能的復(fù)合酵素[5]。藍靛果椰子復(fù)合發(fā)酵的工藝優(yōu)化不僅為藍靛果與椰子的高效利用提供了新的選擇，具有一定的的研究與經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果、椰子：濟南銀座鮮果蔬批發(fā)市場；礦泉水：濟南家家悅超市；酵母菌：齊魯工業(yè)大學(xué)現(xiàn)代釀酒裝置與技術(shù)研究室菌種保藏室；白砂糖：山東博雅食品有限公司；葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、重苯酚、亞硫酸鈉、蘆丁標準品（純度＞98%）、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉：中國藥品生物制品所；花青素3-阿拉伯糖苷（純度＞98%）：上海同田生物技術(shù)股份有限公司；果膠酶（酶活10 000 U/g）、纖維素酶（酶活20 000 U/g）：上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CF-KB片式臭氧發(fā)生器：北京山美水美環(huán)保高科技有限公司；HR7632型打漿機：廣州飛利浦家庭電器有限公司；T4可見分光光度計：北京通用儀器有限公司；TG256A電子天平：上海恒平科技儀器有限公司；HWS26電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；SW-CJ-3D凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GZX-637電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特有限公司；TGL-12G-C高速離心機：上海精密科學(xué)儀器廠；WS-232型立式壓力蒸汽滅菌器：常州市大型儀器設(shè)備中心。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）藍靛果與椰子預(yù)處理

用流動水沖去藍靛果表面泥沙，將臭氧發(fā)生器通入無菌水中再次清洗藍靛果，之后瀝干去核，將果肉粉碎打漿，之后按果漿體積的40%添加礦泉水，同時添加果膠酶2.5%，攪拌混勻后在26℃條件下靜置30 min；椰子去皮，椰子汁導(dǎo)出后，將椰肉挖出，并與椰子汁混合打漿，后加入纖維素酶3%，攪拌均勻，28℃條件下靜置30 min。

（2）發(fā)酵原料及菌種添加

將處理好備用的藍靛果果漿和椰子果漿按適當比例混合，加入到發(fā)酵罐中，按照體積比為5∶6添加純凈水，調(diào)節(jié)pH至6.25、糖度至12%；按照2.7 g/L的接種量添加由酵母菌和雙歧桿菌組成的混合菌種（干菌種添加到15倍質(zhì)量、含2.5%的葡萄糖水中，以25～30℃恒溫活化80～120min），并攪拌混勻。

（3）調(diào)節(jié)控制發(fā)酵

調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至33℃，恒溫密閉發(fā)酵70 d，前50 d每48 h檢測一次發(fā)酵液pH，后20 d每12 h檢測一次，當發(fā)酵液pH降至4且不再產(chǎn)生氣泡時，發(fā)酵結(jié)束。

（4）后熟與過濾

調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至4℃，靜置恒溫密閉保藏30 d，使發(fā)酵原液中的酯、醇、酚類物質(zhì)充分反應(yīng)，生成酵香。后熟處理后，導(dǎo)出發(fā)酵原液，再經(jīng)80～100 r/min離心15 min，過濾取上層清液與中層濁液，棄去下層沉淀與固液混合物，即得藍靛果椰子復(fù)合酵素原液。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

調(diào)整發(fā)酵溫度分別為29℃、31℃、33℃、35℃、37℃；藍靛果與椰子漿質(zhì)量比分別為1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1；酵母菌與雙歧桿菌菌種比例分別設(shè)定為1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1。采用單一變量控制法進行單因素試驗，所有分組樣品發(fā)酵完成后對各組的藍靛果椰子復(fù)合酵素花色苷吸光度值、超氧化物歧化酶（superoxyde dismutase，SOD）酶活力、殘?zhí)橇俊ⅫS酮類物質(zhì)含量進行測定。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（A），藍靛果果漿與椰子果漿質(zhì)量比（B）和酵母菌與雙歧桿菌菌種比例（C）為3個因素，以花色苷吸光度值、SOD酶活力、殘?zhí)橇?、黃酮類物質(zhì)含量為考察指標，進行正交試驗，優(yōu)化藍靛果椰子復(fù)合酵素發(fā)酵工藝條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 藍靛果椰子復(fù)合酵素的工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for process optimization ofLonicera caeruleaand coconut compound enzyme

1.3.5 SOD酶活測定

酶活力單位的定義：在1mL反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個酶活力單位。SOD酶活力測定：參照文獻[6]中的方法，其計算公式如下：

式中：A0為自氧化速率，min-1；A1為加入酶后的氧化速率，min-1；N為稀釋倍數(shù)；V0為定義體積，mL；Va為反應(yīng)總體積，mL；VE：加入的酶體積，mL。

1.3.6 其他指標測定

（1）花色苷含量測定

利用體積分數(shù)為75%的酸化乙醇（向75%的乙醇中添加濃HCl，調(diào)節(jié)pH值為3～4）提取復(fù)合酵素中的花色苷，測定其吸光度值，得到波長325 nm處花色苷標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)，借此可間接測得花色苷的含量。

花色苷標準曲線的制作：通過紫外分光光度計分別測定不同質(zhì)量濃度花色苷標準溶液在波長520 nm處的吸光度值，以花色苷的質(zhì)量濃度（x,mg/g）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，制作花色苷標準曲線，得到標準回歸曲線方程：y=0.047 6x+0.007 2，R2=0.997 2。

（2）蛋白質(zhì)含量測定：采用國標GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。

（3）脂肪含量測定：采用索式提取法[7]。

（4）總糖和還原糖含量測定：采用費林試劑直接滴定法。

（5）氨基酸含量的測定：采用國標GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》中的方法進行測定。

（6）維生素C含量的測定：采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中2,6-二氯靛酚滴定法。

（7）還原糖含量測定：采用DNS法[8]。

（8）黃酮類物質(zhì)含量測定：采用分光光度法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍靛果、椰子的基本成分

制作酵素前，結(jié)合已知數(shù)據(jù)文獻和實際測定，得到藍靛果果漿和椰子果漿的總糖、蛋白質(zhì)、花色苷、黃酮類物質(zhì)等成分的含量，結(jié)果分別見表2和表3。

表2 藍靛果果漿基本成分及含量[10]Table 2 Basic components and contents ofLonicera caeruleapulp

表3 椰子果漿基本成分及含量[11]Table 3 Basic components and contents of coconut pulp

由表2和表3可知，藍靛果中還有豐富的氨基酸、維生素以及大量的黃酮和花色苷，椰油是良好的食用油脂，類脂物的含量很少，食用后不會使人體血液中的膽固醇含量增加。兩種水果的含糖量較高，是制作酵素優(yōu)選材料。其中藍靛果中的花色苷，是純天然的抗衰老的營養(yǎng)補充劑，它的抗氧化性能比維生素E和維生素C高出若干倍?；ㄉ站哂性鰪娨暳Γ劬ζ诤脱泳從X神經(jīng)衰老的功能。椰肉味干，性平，具有補益脾胃的功能。以藍靛果和椰子作為酵素原料，既提高了酵素的營養(yǎng)含量，也互補了兩種水果的風(fēng)味口感。

2.2 發(fā)酵溫度對藍靛果椰子復(fù)合酵素發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度的高低將直接影響復(fù)合酵素中菌體的生長，不同溫度對發(fā)酵產(chǎn)品影響結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵溫度對復(fù)合酵素發(fā)酵的影響Table 4 Effect of fermentation temperature on compound enzyme fermentation

由表4可知，隨著發(fā)酵溫度改變，復(fù)合酵素中SOD酶含量與殘?zhí)橇恳舶l(fā)生了明顯變化，SOD酶含量先逐漸升高后快速降低，殘?zhí)橇恐饾u下降但趨勢放緩。分析可知，當發(fā)酵溫度較低時，混合菌種代謝緩慢，特別是雙歧桿菌生理活動較弱，代謝物SOD酶及各種產(chǎn)物含量較低，殘?zhí)橇扛?，整體發(fā)酵效率低；當發(fā)酵溫度逐漸升高時，高溫抑制了混合菌種內(nèi)酶的活性，進而抑制菌種的生長與代謝，所產(chǎn)生的酶量與各產(chǎn)物減少，整體表觀活性有所下降；當發(fā)酵溫度在33℃左右時，酵母菌代謝旺盛，SOD酶含量最高、活性最強，殘?zhí)呛枯^低。發(fā)酵溫度過高或過低均不能達到混合菌種的最大發(fā)酵效率。因此選擇33℃作為藍靛果椰子復(fù)合酵素的發(fā)酵溫度。

2.3 藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比對復(fù)合酵素發(fā)酵的影響

不同藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比對發(fā)酵產(chǎn)品的影響結(jié)果見表5。

由表5可知，隨著藍靛果果漿比例的逐漸增大，花色苷吸光度值（即花色苷含量）和總黃酮含量不斷上升，但上升趨勢趨于平緩；同時殘?zhí)橇恳舶l(fā)生了變化，隨著椰果果漿添加量的降低而大幅減少，隨藍靛果添加比例的提高而慢慢增加。分析數(shù)據(jù)可知，由于花色苷和黃酮類物質(zhì)主要存在于藍靛果中，隨藍靛果添加比例的提高而增加，但由于底物濃度不斷提高，花色苷和黃酮類物質(zhì)在復(fù)合酵素發(fā)酵原液中的溶解度不斷降低，故其含量的增加趨勢逐漸放緩；由于發(fā)酵前需要調(diào)節(jié)糖度至12%，故物料配比對殘?zhí)橇康挠绊懣珊雎圆挥嫛Ｒ虼?，選擇藍靛果漿與椰子果漿質(zhì)量比為5:1。

表5 原料比例對復(fù)合酵素的影響Table 5 Effect of ratio of raw materials on compound enzyme fermentation

2.4 菌種比例對藍靛果椰子復(fù)合酵素發(fā)酵的影響

不同酵母菌與雙歧桿菌配比對發(fā)酵產(chǎn)品的影響結(jié)果見表6。

由表6可知，在復(fù)合菌種中，隨著酵母菌添加比例的提高，復(fù)合酵素原液中花色苷的含量和殘?zhí)橇坎粩嘞陆?，而SOD酶含量不斷增加，總黃酮量基本保持穩(wěn)定。分析可知，酵母菌屬兼性好氧菌，對糖分的利用途徑和效率均優(yōu)于屬厭氧菌的雙歧桿菌，因此酵母菌所產(chǎn)生的SOD酶產(chǎn)量與自身含量成正相關(guān)，且酵母菌添加比例越高，復(fù)合酵素中殘?zhí)呛烤驮降?；雙歧桿菌的代謝主產(chǎn)物為乙酸與乳酸，而花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，花色素在酸性環(huán)境中易保持穩(wěn)定，故花色苷含量與雙歧桿菌含量成正相關(guān)。綜合考慮發(fā)酵效率與抗氧化功效，選取酵母菌與雙歧桿菌配比為2∶1為最佳。

2.5 正交試驗結(jié)果分析

為確定藍靛果椰子復(fù)合酵素各關(guān)鍵參數(shù)，設(shè)計3因素3水平L9（33）正交試驗，以發(fā)酵溫度、藍靛果果漿與椰子果漿質(zhì)量比、酵母菌與雙歧桿菌配比為3個影響因素，對藍靛果椰子復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表8。

由表8可知，3個因素對藍靛果椰子復(fù)合酵素中花色苷含量的影響結(jié)果排序為藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比＞發(fā)酵溫度=酵母與雙歧桿菌配比，最佳組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度為33℃，藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比為5:1，酵母與雙歧桿菌配比為2:1，此工藝條件下花色苷含量為12.17 mg/g，總黃酮含量20.31 mg/g、SOD酶活力為56.74 U/mL、殘?zhí)橇繛?.22 mg/mL。3個因素對藍靛果椰子復(fù)合酵素中總黃酮含量的影響結(jié)果排序為藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比＞酵母與雙歧桿菌配比＞發(fā)酵溫度，最佳組合為A2B3C1，即發(fā)酵溫度為33℃，藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比為7:1，酵母與雙歧桿菌配比為2:3，此工藝條件下花色苷含量為10.012 mg/g，總黃酮含量27.22 mg/g，SOD酶活力為56 U/mL、殘?zhí)橇繛?.58 mg/mL。3個因素對藍靛果椰子復(fù)合酵素中SOD酶活力的影響結(jié)果排序為發(fā)酵溫度＞藍靛果與椰子質(zhì)量比＞酵母與雙歧桿菌配比，最佳組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度為33℃，藍靛果與椰子質(zhì)量比為5:1，酵母與雙歧桿菌配比為2:1，此工藝條件下花色苷含量為12.17 mg/g、總黃酮含量20.31mg/g、SOD酶活力為56.74U/mL、殘?zhí)橇繛?.22mg/mL。3個因素對藍靛果椰子復(fù)合酵素中殘?zhí)橇康挠绊懡Y(jié)果排序為酵母與雙歧桿菌配比＞發(fā)酵溫度＞藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比，最佳組合為A3B1C3，即發(fā)酵溫度為35℃，藍靛果與椰子質(zhì)量比為3:1，酵母與雙歧桿菌配比為2:1，此工藝條件下花色苷含量為10.639 mg/g、總黃酮含量20.67 mg/g、SOD酶活力為48.98 U/ml、殘?zhí)橇繛?.13 mg/mL。

綜合考慮，藍靛果椰子復(fù)合酵素發(fā)酵工藝以A2B2C3組合為最佳釀造工藝。此工藝條件下，產(chǎn)生的復(fù)合酵素中花色苷含量為12.17 mg/g，總黃酮含量20.31 mg/g、SOD酶活力為56.74 U/mL、殘?zhí)橇繛?.22 mg/mL。成品為深紫紅色，具有藍靛果與椰奶香氣。

2.7 產(chǎn)品的品質(zhì)指標分析

2.7.1 產(chǎn)品感官指標

色澤：顏色呈深紫紅色，色澤均勻、透亮；口感：自然醇厚，入口順滑，微酸[12]；香氣：果香芬芳，椰奶香味足，優(yōu)雅協(xié)調(diào)；滋味：酸甜適口，味道調(diào)和，果味濃郁；組織狀態(tài)：體態(tài)均勻，無沉淀、無懸浮物。

2.7.2 產(chǎn)品理化指標

表9 藍靛果椰子復(fù)合酵素的理化指標Table 9 physicochemical indexes ofLonicera caeruleaand coconut compound enzyme

2.7.3 微生物指標

表10 復(fù)合酵素的微生物指標Table 10 Microbial indexes ofLonicera caeruleaand coconut compound enzyme

結(jié)果表明，該工藝條件下制得的藍靛果椰子復(fù)合酵素符合國標GB 25594—2010《食品工業(yè)用酶制劑》以及GB 2758—2012《發(fā)酵酒及其配制酒》中相關(guān)要求。

3 結(jié)論

通過單因素及正交試驗分析，藍靛果椰子復(fù)合酵素的最佳工藝確定為：發(fā)酵溫度33℃發(fā)酵70 d，藍靛果與椰子果漿質(zhì)量比為5:1，酵母菌與雙歧桿菌配比為3:2。此工藝下生產(chǎn)的藍靛果椰子復(fù)合酵素，其品質(zhì)指標均符合相關(guān)國標要求[13]。

該復(fù)合酵素采用東北藍靛果和南方椰子作原材料進行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品顏色呈鮮紫色，液體通透，同時藍靛果特有的花色苷作為一種效用明顯的抗氧化劑能有效防止色素氧化[14-15]，提高了復(fù)合酵素的穩(wěn)定性，延長了酵素的保質(zhì)期；利用椰子汁和椰子肉特有的椰淡奶香風(fēng)味彌補了藍靛果的微苦澀的口感，口感自然醇厚，入口綿柔順滑，酸度適宜；氣味上，椰子獨特的椰淡奶香味混合藍靛果濃厚的果香味，椰香與果香渾然一體、互相交疊，給人帶來極大的舒適與滿足感；本實驗研究一種新型復(fù)合酵素的釀制工藝，為藍靛果與椰子的深加工提供了新的途徑，為酵素研發(fā)領(lǐng)域提供了新的思路。

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Optimization of fermentation process ofLonicera caeruleaand coconut compound enzyme

ZHAN Weiwei1,WEI Xiaoyu2,GAO Benjie2,LI Jinglong2*(1.College of Food and Drug,Shandong Institute of Commerce and Technology,Jinan 250103,China; 2.College of Bioengineering,Qilu University of Technology,Jinan 250353,China)

The fermentation process of compound enzyme solution was researched withLonicera caeruleaand coconut as the main raw material.The effects of three main factors,such as fermentation temperature,ratio of raw materials and starter culture proportion,on the activity of compound enzyme were analyzed by single factor experiments.Using the anthocyanin content,superoxide dismutase(SOD)activity,residual sugar and total flavonoid contents as evaluation indexes,the optimum process conditions ofLonicera caeruleaand coconut compound enzyme were determined by orthogonal experiments.The results showed that the anthocyanins content,total flavonoid content,SOD activity and residual sugar content in the L.caeruleaand coconut compound enzyme were 12.17 mg/g,20.31 mg/g,56.74 U/ml and 4.22 mg/ml,respectively,with the conditions of fermentation temperature 33℃,time 70 d,ratio of yeast andBifidobacterium2:1,the mass ratio ofL.caeruleaand coconut 5:1,.The compound enzyme obtained was appropriate acidity,prominent fragrance and unique taste.

Lonicera caerulea;coconut;compound enzyme;fermentation process

TS262.7

0254-5071（2017）01-0191-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.040

2016-08-12

濟南市科技創(chuàng)業(yè)企業(yè)支持計劃（201502109）

戰(zhàn)偉偉(1980-)，女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)。

*通訊作者：李敬龍（1961-），男，教授，本科，研究方向為生物活性物質(zhì)。