黃 霞，劉 芳，聶 立，蘭瑞容，彭章明

(宜賓市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川宜賓644000)

高效液相色譜法測(cè)定牛奶中速滅威、克百威、異丙威農(nóng)藥殘留

黃 霞，劉 芳，聶 立，蘭瑞容，彭章明

(宜賓市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川宜賓644000)

建立了牛奶中速滅威、克百威（呋喃丹）、異丙威的高效液相色譜測(cè)定與確證方法。3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好；相關(guān)系數(shù)R2為0.990～0.996；檢出限為6.13～7.87 μg/kg；回收率為70.4%～102.5%。該方法準(zhǔn)確、靈敏、快速，可滿足檢測(cè)需要。

牛奶；高效液相色譜；速滅威；克百威；異丙威

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是繼有機(jī)磷、有機(jī)氯農(nóng)藥之后廣泛使用的殺蟲劑，此類殺蟲劑進(jìn)入人體內(nèi)可抑制乙酰膽堿酯酶，造成急性中毒，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)人類健康存在潛在的危險(xiǎn)。該類農(nóng)藥是以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的農(nóng)藥，具有分解快、殘留期短、低毒、高效和選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，主要用于糧食、蔬菜和水果等農(nóng)產(chǎn)品[1]。隨著氨基甲酸酯類殺蟲劑施用于土壤中，可防治土壤中的多種害蟲和線蟲，但容易導(dǎo)致在植物中的殘留，給食草性動(dòng)物食品帶來新的使用安全問題。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法體系中有關(guān)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)方法有GB/T5009.199—2003《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)》[2]；SN/T 2572—2010《進(jìn)出口蜂王漿中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[3]；GB/T 5009.163—2003《動(dòng)物性食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多組分殘留高效液相色譜測(cè)定》[4]；NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》[5-6]。在國(guó)內(nèi)外的分析報(bào)道中，檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometer，GC-MS/MS）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometer，HPLC-MS/MS）等[7-13]。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，由于氨基甲酸酯類化合物極性強(qiáng)，熱穩(wěn)定性較差，使用GC或GC-MS檢測(cè)時(shí)常需采用特殊的技術(shù)和手段才能準(zhǔn)確測(cè)定且方法復(fù)雜。諸多方法中，雖然液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已趨近成熟，但其成本昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以推廣應(yīng)用。而高效液相色譜法檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留具有選擇性強(qiáng)、靈敏度較高、重現(xiàn)性較好且易于實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)。本研究期望探索建立一種檢測(cè)牛奶中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的簡(jiǎn)便、高效、快速的高效液相色譜分析檢測(cè)技術(shù)，這對(duì)保證牛奶產(chǎn)品質(zhì)量安全、保障人們生命健康以及加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)均有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸鉛（分析純）、乙腈（色譜純）：山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；異丙威標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.5%）、速滅威標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；克百威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）：北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測(cè)器、XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱：美國(guó)安捷倫公司；AE240電子天平：美國(guó)METTLER公司；JM-B10002電子天平：余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取異丙威0.014 7 g、速滅威0.013 8 g標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1.45 mg/mL的異丙威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為1.35 mg/mL的速滅威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取速滅威和異丙威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10 mL，克百威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL于同一10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（異丙威質(zhì)量濃度為14.5μg/mL，速滅威質(zhì)量濃度為13.5μg/mL，克百威質(zhì)量濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液）。再取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1.00 mL到10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，得到異丙威質(zhì)量濃度為1.45 μg/mL，速滅威質(zhì)量濃度為1.35 μg/mL，克百威質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：0.2mL、0.5mL、1mL至進(jìn)樣瓶中，甲醇稀釋至1mL；再分別取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：0.2 mL、0.3 mL至進(jìn)樣瓶中，甲醇精確稀釋至1.0 mL，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取混勻樣品（約30 g，純牛奶）于50 mL離心管中，吸取乙腈20.00 mL，加入4 g氯化鈉，2 mL乙酸鉛溶液，劇烈振搖2 min，超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液5.00 mL于10 mL試管中，氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確吸取1.00 mL甲醇復(fù)溶，過0.45 μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水（50∶50，V/V）；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5μL；二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)：210nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以待測(cè)組分質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到線性回歸方程y=ax+b，結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 1 Standard curve regression equations

由表1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996、0.993、0.990，線性關(guān)系較好。

2.2 檢測(cè)限

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線STD1最低點(diǎn)濃度的信噪比（標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度的色譜圖見圖1），將3倍信噪比時(shí)的待測(cè)組分濃度作為儀器最低檢測(cè)濃度，再根據(jù)樣品前處理的稀釋倍數(shù)及取樣量，計(jì)算出本方法的檢測(cè)限，結(jié)果見表2。

由表2可知，3種農(nóng)藥檢測(cè)限分別為速滅威6.13 μg/kg，克百威6.93 μg/kg，異丙威7.87 μg/kg。本方法測(cè)得的檢出限低于GB/T 5009.163—2003（速滅威為7.8 μg/kg，克百威7.3 μg/kg，異丙威13.3 μg/kg）的要求，滿足檢測(cè)要求。

圖1 混標(biāo)溶液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards

表2 3種農(nóng)藥的檢測(cè)限Table 2 Detection limits of three pesticides

2.3 加標(biāo)回收率

選取未含待測(cè)組分的牛奶作為加標(biāo)試樣，3個(gè)水平每個(gè)水平6個(gè)平行。進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of adding standard recoveries

由表3可知，該方法回收率為70.4%～102.5%，能滿足檢測(cè)要求。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

在GB/T 5009.163—2003方法中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中所用的萃取溶劑為丙酮和二氯甲烷的混合溶液，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，添加0.02 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于樣品中，分別用丙酮40 mL和二氯甲烷30 mL的混合溶液和乙腈20 mL進(jìn)行萃取，試驗(yàn)結(jié)果表明，使用丙酮和二氯甲烷作為提取溶劑的回收率明顯低于乙腈作為提取劑的回收率[8]。綜合考慮提取效率、基質(zhì)干擾、樣品的選擇性、與樣品混合性、溶劑化作用和滲透能力等因素，本方法采用乙腈作為氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的提取劑[14-17]。

3.2 凈化方式的選擇

在GB/T 5009.163—2003方法中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析采用的凈化方式為凝膠柱，凝膠的價(jià)格昂貴，成本很高。因此本實(shí)驗(yàn)考察了C18小柱、PEP固相萃取小柱和乙酸鉛沉淀蛋白質(zhì)三種凈化方式，結(jié)果表明，使用C18小柱、PEP固相萃取小柱凈化的樣品回收率很低，而使用乙酸鉛沉淀蛋白質(zhì)進(jìn)行凈化的樣品回收率能滿足檢測(cè)需要[9-10]。牛奶樣品中色素含量很低，而脂肪和蛋白質(zhì)含量較高，通過乙酸鉛沉淀離心后，明顯分層。直接取上清液氮吹，濃縮，定容，上機(jī)，操作過程中損失小，且操作方便，可以滿足檢測(cè)需要[18]。

3.3 流動(dòng)相的選擇

對(duì)3種待測(cè)物進(jìn)行紫外光譜掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)均為210 nm，GB/T 5009.163—2003種選用的流動(dòng)相為甲醇+水（60+40），而在此流動(dòng)相下，標(biāo)準(zhǔn)品中的色譜雜峰較多，且雜峰響應(yīng)值高，影響待測(cè)組分檢測(cè)，分析原因主要是甲醇的紫外最大吸收波長(zhǎng)為200 nm附近，所當(dāng)待測(cè)組分檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，干擾較大。將流動(dòng)相換為（乙腈+水）=（50+50），乙腈紫外最大吸收波長(zhǎng)為190 nm附近，比甲醇低，適合待測(cè)組分的檢測(cè)。調(diào)整流動(dòng)相比例為（乙腈+水）=（50+50），使雜質(zhì)與待測(cè)組分分離，靈敏度也能滿足檢測(cè)的需要。

3.4 結(jié)果及存在的問題

實(shí)驗(yàn)中待測(cè)組分的響應(yīng)值還不夠理想，為了達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)檢出限，本方法采用增大稱樣量的方式。在未來的研究中，主要還可以從前處理和儀器條件兩大方面來提高待測(cè)組分的響應(yīng)值，可以增大進(jìn)樣體積，本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)樣體積為5μL，進(jìn)樣體積較小，且牛奶樣品相對(duì)含有色素及其他雜質(zhì)較少，前處理相對(duì)較為簡(jiǎn)單，在未來的研究中還可以針對(duì)不同的樣品進(jìn)行前處理的優(yōu)化。

4 結(jié)論

本方法對(duì)提取溶劑、凈化方式和流動(dòng)相做了優(yōu)化。速滅威檢測(cè)限為6.13 μg/kg、克百威檢測(cè)限為6.93 μg/kg、異丙威檢測(cè)限為7.87 μg/kg，低于GB/T5009.163—2003方法中的檢測(cè)限（速滅威7.8 μg/kg、克百威（呋喃丹）7.3 μg/kg、異丙威13.3 μg/kg），說明本方法比標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)限更低，更能滿足檢測(cè)需要。

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[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.163—2003動(dòng)物性食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多組分殘留高效液相色譜測(cè)定[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

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Determination of metolcarb,carbofuran and isoprocarb contents in milk by HPLC

HUANG Xia,LIU Fang,NIE Li,LAN Ruirong,PENG Zhangming(Yibin Institute for Food and Drug Control,Yibin 644000,China)

A new method for determination and conformation of metolcarb,carbofuran,and isoprocarb in milk by HPLC was developed.The proposed method showed a good linearity with the linear correlation coefficientsR2of 0.990-0.996 and detection limits of 6.13-7.87 μg/kg.The average recoveries were in the range of 70.4%-102.5%.The method was accurate,sensitive,rapid,and can meet the needs of detection.

milk;HPLC;metolcarb;carbofuran;isoprocarb

O657.7

0254-5071（2017）01-0168-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.035

2016-08-13

黃霞（1986-），女，工程師，碩士，主要從事食品檢測(cè)工作。