2014—2016年四川省豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的血清學(xué)調(diào)查

，2*（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物生物技術(shù)中心，四川 成都 630；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 630）

2014—2016年四川省豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的血清學(xué)調(diào)查

楊 凡1，呂文婷1，許思遙1，毛汐語1，殷 玥1，徐志文1，2*
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130）

欄目協(xié)辦

為掌握近年來四川省現(xiàn)有防控體系下豬瘟（CSF）、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的感染和流行情況，對2014年1月—2016年6月采集于四川省共16個地區(qū)的6 489份血樣，運(yùn)用 ELISA方法進(jìn)行CSFV和PRRSV血清學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，2014—2016年CSFV抗體陽性率分別為78.70%、80.25%和82.08%，PRRSV抗體陽性率分別為75.97%、87.16%和88.31%；綿陽、眉山、樂山和宜賓等地的CSFV或PRRSV抗體水平低于60%，與另一種相比差異較大，可能存在免疫干擾或野毒感染；哺乳仔豬和斷奶仔豬的CSFV抗體陽性率偏低，各日齡段豬群PRRSV抗體水平較理想。結(jié)果提示，四川地區(qū)豬群的CSFV、PRRSV抗體陽性率良莠不齊，有必要對飼養(yǎng)管理方式和免疫程序等做適當(dāng)調(diào)整，以防控臨床野毒的感染。

豬瘟；豬繁殖與呼吸綜合征；ELISA；血清學(xué)調(diào)查

豬瘟(Classical swine fever， CSF)和豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine repro ductive and respiratory syndrome， P RRS)是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重大病毒性傳染病，均可引起母豬繁殖障礙、仔豬高發(fā)病率和死亡率、隱性感染豬生長不佳等癥狀[1，2]，豬場一旦感染發(fā)病將損失慘重。為掌握四川省現(xiàn)有防控體系下CSFV和PRRSV的感染和免疫情況，本研究對2014年1月-2016年6月采集自成都、眉山和遂寧等四川省共16個地區(qū)的大/中/小型養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶和屠宰場的6 489份血清樣品，以IDEXX公司ELISA抗體檢測試劑盒開展CSFV和PRRSV血清學(xué)調(diào)查工作，為科學(xué)防控疫病感染提供依據(jù)，為后期開展流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究于2014年1月—2016年6月，從成都、眉山和遂寧等四川省共16個地區(qū)的大/中/小型養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶和屠宰場共采集血清樣品6 489份(大豬前腔靜脈采血，仔豬耳緣靜脈采血)，其中哺乳仔豬857份，斷奶仔豬724份，保育豬1 446份，育肥豬697份，經(jīng)產(chǎn)母豬1 963份，后備母豬375份，種公豬427份。

將采集血樣于室溫靜置1 h[3]，析出血清后，轉(zhuǎn)移至滅菌EP管中，盡快送回實驗室檢測。

1.2 主要材料與試劑

IDEXX-CSFV/PRRSV抗 體檢測試劑盒(四川佑策農(nóng)業(yè)技術(shù)咨詢有限公司)；BIO-RAD酶標(biāo)儀(成都百樂科技有限公司)；Thermo Micro21R微量離心機(jī)(賽默飛成都分公司)；10/200/1000 μL單道微量加樣器(賽默飛成都分公司)。

1.3 CSFV抗體檢測

嚴(yán)格按照IDEXX-CSFV抗體檢測試劑盒說明書操作，運(yùn)用阻斷ELISA方法檢測待檢血清中的CSFV抗體。僅當(dāng)陰性對照的平均A450值大于0.50，陽性對照的阻斷率大于50%，試驗結(jié)果才成立。阻斷率=(陰性對照平均A450值-樣品A450值)/陰性對照平均A450值×100%。若被檢樣品阻斷率≤30%，判定該樣品為CSFV抗體陰性；若被檢樣品阻斷率≥40%，判定該樣品為CSFV抗體陽性；若阻斷率介于30%和40%之間，檢測結(jié)果可疑，需重新測定。

1.4 PRRSV抗體檢測

嚴(yán)格按照IDEXX-PRRSV抗體檢測試劑盒說明書操作，運(yùn)用間接ELISA方法檢測待檢血清中的PRRSV抗體。當(dāng)陽性對照的平均A650值減去陰性對照的平均A650值大于或等于0.150，且陰性對照的平均A650值小于或等于0.150，試驗結(jié)果才可信。S/P值=(樣本A650值-陰性對照平均A650值)/(陽性對照平均A650值-陰性對照平均A650值)。若被檢樣品S/P值＜0.40，判定該樣品為PRRSV抗體陰性；若被檢樣品阻斷率≥0.40，判定該樣品為PRRSV抗體陽性。

2 結(jié)果

2.1 2014-2016年四川省血清樣品的CSFV、PRRSV抗體檢測結(jié)果

對采集2014年(2 301份)、2015年(2 648份)和2016年(1 540份)的血清樣品分別進(jìn)行CSFV和PRRSV抗體檢測，發(fā)現(xiàn)近年來CSFV、PRRSV血清抗體陽性率呈現(xiàn)緩慢增長，2016年達(dá)到82.08%和88.31%（表1、圖1），且兩者平均抗體水平相差不大，從一定層面反映出目前四川地區(qū)大多數(shù)養(yǎng)殖場已逐漸重視和加強(qiáng)對CSFV和PRRSV的防控。

圖1 四川省不同年份血清樣品的CSFV、PRRSV抗體檢測結(jié)果

圖2 四川省不同地區(qū)血清樣品的CSFV、PRRSV抗體檢測結(jié)果

表1 2014-2016年四川省血清樣品的抗體檢測結(jié)果

表2 四川省不同地區(qū)血清樣品的抗體檢測結(jié)果

2.2 四川省不同地區(qū)豬群血清樣品的CSFV、PRRSV抗體檢測結(jié)果

統(tǒng)計四川成都、眉山和遂寧等共16個地區(qū)的大/中/小型養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶和屠宰場血清樣品的CSFV和PRRSV抗體檢測結(jié)果(表2、圖2)，發(fā)現(xiàn)阿壩州CSFV和PRRSV血清抗體陽性率均達(dá)100%；樂山、德陽的CSFV抗體陽性率最低僅達(dá)55.52%和65.57%；南充、廣安和攀枝花的PRRSV陽性率達(dá)100%，而宜賓、綿陽和眉山的抗體陽性率僅為51.61%、54.10%和59.58%。綜合比對各地區(qū)的CSFV和PRRSV抗體陽性率，發(fā)現(xiàn)綿陽、眉山、樂山和宜賓共4個地區(qū)的CSFV和PRRSV抗體水平差異約達(dá)20%以上，考慮到各地區(qū)、各階段豬群基本按等比例采樣，不排除有兩種疫苗的免疫干擾或野毒感染的可能性。

2.3 不同日齡豬群血清樣品的CSFV、PRRSV抗體檢測結(jié)果

比對不同日齡豬群血清樣品的CSFV和PRRSV抗體檢測結(jié)果(表3、圖3)，從哺乳仔豬和斷奶仔豬來看，由于喂食初乳或?qū)嵭谐懊庖撸ㄒ话銥镻RRSV），所以抗體陽性率可達(dá)65%以上，隨著母源抗體的衰減，CSFV抗體水平會在21～30 d左右降到低谷，此時經(jīng)首免后回升；而PRRSV抗體水平在此階段相對較高，超前免疫和母源抗體都起到一定作用。隨后豬群進(jìn)入保育豬和育肥豬階段，此時可選后備豬供生殖繁育，豬只在此階段由于二免（部分豬場可做三免）其體內(nèi)抗體水平可持續(xù)上升，包括先前部分免疫失敗或免疫質(zhì)量差的豬。經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬其CSF一般施行普免和跟胎免疫，PRRS疫苗則不免，以防引起新生胎兒帶毒感染，因而此時CSFV抗體水平相對較高。

3 討論

CSF是由世界動物衛(wèi)生組織(OIE)定性的A類傳染病，急性型可導(dǎo)致感染豬迅速死亡，慢性型和遲發(fā)型主要影響生長發(fā)育，感染豬可長期向外排毒。我國于1955年研發(fā)的兔化弱毒苗在CSF的控制和凈化上做出了很大貢獻(xiàn)，但近幾年非典型CSF的出現(xiàn)給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大挑戰(zhàn)。機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答可能因為感染豬的胸腺萎縮而被抑制[4]，同時由CSFV弱毒持續(xù)隱性感染形成的疫苗免疫耐受[5，6]而導(dǎo)致的中和抗體滴度低于保護(hù)水平，最終導(dǎo)致CSF免疫失敗。PRRS最早是在20世紀(jì)80年代末期的美國中西部發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)首株病毒是由郭寶清于1996年在流產(chǎn)胎兒中分離獲得。PRRSV有經(jīng)典藍(lán)耳(C-PRRSV)和高致病性藍(lán)耳(H-PRRSV)之分，國內(nèi)的H-PRRSV分離株在NSP2蛋白上相對于經(jīng)典株均有將近30個氨基酸殘基的缺失，其他蛋白基因位點也存在一定變異[7]。有研究表明，PRRSV弱毒疫苗在感染豬體內(nèi)增殖時可朝H-PRRSV定向突變，且自然環(huán)境中的PRRSV野毒之間、疫苗毒和野毒之間都存在一定的重組現(xiàn)象[8]，這些變異均可能提高PRRSV的致病力，以抵抗機(jī)體免疫。PRRSV可靶向侵染豬的肺泡巨噬細(xì)胞，或在感染早期通過誘導(dǎo)分化抑制性T細(xì)胞來克制輔助性T細(xì)胞的活性，間接阻遏機(jī)體細(xì)胞免疫，以此引起免疫抑制[9]，使病毒進(jìn)一步逃脫機(jī)體免疫。正是這一系列免疫逃避機(jī)制，形成了CSFV和PRRSV兩種病毒對我國養(yǎng)豬業(yè)的威脅。

表3 不同日齡豬群血清樣品的抗體檢測結(jié)果

圖3 不同日齡豬群血清樣品的CSFV、PRRSV抗體檢測結(jié)果

同時，CSFV和PRRSV常形成混合感染。2008年王波等[10]對陜西省收集的146份樣品進(jìn)行CSFV、PRRSV、PRV和PCV2病原檢測，發(fā)現(xiàn)“CSFV+PRRSV”混合感染率高達(dá)25%；2011年舒相華等[11]對云南收集的1 164份血清樣品應(yīng)用ELISA和RT-PCR進(jìn)行PRV gE、PCV2抗體和CSFV、PRRSV抗原檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“CSFV+PRRSV”混合感染率達(dá)5.79%；2014年，張裕祺[12]對江西地區(qū)546份保育豬樣品進(jìn)行CSFV、PRRSV、PCV2和PRV分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)“CSFV+PRRSV”感染率達(dá)31.8%。由此可見，二者混合感染的形勢也不容小覷。

針對CSFV和PRRSV免疫抑制和混合感染對養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大威脅，科學(xué)合理的免疫防控措施舉足輕重，而ELISA技術(shù)可準(zhǔn)確反映出機(jī)體免疫或疾病的感染狀況，被用作日常監(jiān)測豬群抗體水平的首選方法。此次對四川省成都、眉山和遂寧等共16個地區(qū)的大/中/小型養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶和屠宰場的6 489份血清樣品進(jìn)行CSFV和PRRSV抗體檢測，發(fā)現(xiàn)在2014—2016年內(nèi)兩者抗體陽性率均在70%以上，達(dá)到農(nóng)業(yè)部基本要求，且呈逐年上升趨勢，一定程度反映出四川地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)對二者防控的日漸重視。

從單一層面看不同地區(qū)的調(diào)查結(jié)果，樂山和德陽地區(qū)CSFV免疫效果較差，宜賓、綿陽和眉山地區(qū)的PRRSV免疫效果較差；綜合看來，綿陽、眉山、樂山和宜賓共4個地區(qū)的CSFV和PRRSV抗體水平差異過大（20%以上）。據(jù)此分析可能有2個原因：一方面是免疫程序、疫苗質(zhì)量和飼養(yǎng)管理等問題，另一方面可能由于兩者免疫時間間隔不合理，從而導(dǎo)致免疫干擾現(xiàn)象的產(chǎn)生，甚至有野毒隱性感染，在臨床生產(chǎn)中應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)重視、注意調(diào)整。

對于不同日齡豬群的檢測結(jié)果，可通過與臨床檢測血清樣品的平均陽性率范圍相比較，大致評估CSFV和PRRSV的免疫和感染情況。就CSFV分析，哺乳仔豬和斷奶仔豬在30 d左右豬群抗體陽性率可能在20%左右（母源抗體衰減），若陽性率高達(dá)80%以上，考慮有野毒感染，也不排除垂直傳播感染；隨著日齡的不斷增加，保育豬、育肥豬、后備豬經(jīng)過二免，經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬經(jīng)普免，體內(nèi)抗體可達(dá)到較高水平，群體陽性率自然會升高，若出現(xiàn)陽性率較低的狀況，則應(yīng)當(dāng)考慮免疫不合格。就PRRSV抗體水平分析，很多豬場對新生仔豬實行超前免疫，加上一直從初乳中獲得天然被動免疫，哺乳仔豬和斷奶仔豬出現(xiàn)較高抗體陽性率應(yīng)屬正常；經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬由于未免PRRSV弱毒疫苗，其抗體陽性率維持在70%左右比較合理。目前臨床上使用的CSFV和PRRSV抗體檢測試劑盒尚無法區(qū)分疫苗抗體和野毒抗體，若想避免病毒垂直傳播給胎兒，可活體采集扁桃體樣本或公豬精液進(jìn)行RT-PCR檢測，從而淘汰隱性感染豬。

總體來看四川地區(qū)的CSFV和PRRSV免疫效果并不樂觀，可適當(dāng)調(diào)整免疫程序和飼養(yǎng)管理模式。從疫苗上講，要甄選疫苗種類、嚴(yán)格把控疫苗質(zhì)量(抗原含量是否達(dá)標(biāo)、疫苗是否真空、是否從正規(guī)渠道購買)等，市售的疫苗種類繁多、免疫效果不盡相同，比如用于CSFV免疫的細(xì)胞苗和脾淋苗[13]、用于PRRSV防疫的弱毒苗和滅活苗[14]，應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床免疫效果進(jìn)行篩選或者混合使用，但值得注意的是PRRSV弱毒疫苗可能存在毒力返強(qiáng)和垂直傳播的風(fēng)險，因此對于無PRRSV豬場和經(jīng)產(chǎn)母豬、后備母豬及種公豬應(yīng)當(dāng)慎用。疫苗的使用劑量也尤為重要，劑量過低無法刺激機(jī)體產(chǎn)生合格的中和抗體水平，劑量太高容易導(dǎo)致豬只后期免疫耐受。從免疫時間上講，豬場可借助ELISA方法監(jiān)測仔豬母源抗體消長規(guī)律以確定首免、二免等日齡，并定期采血監(jiān)測抗體水平以進(jìn)行補(bǔ)免，同時考慮到兩種疫苗之間的免疫干擾[15]，可間隔7 d以上免疫，且PRRSV疫苗可先于CSFV疫苗免疫。從飼養(yǎng)管理方面講，養(yǎng)殖人員應(yīng)當(dāng)合理搭配日糧，做好圈舍的日常清洗消毒工作，實時觀測記錄豬群生長情況以利于及時防控疫情、防止繼發(fā)感染；對不同日齡段豬群，甚至不同胎次仔豬，嚴(yán)格分群飼養(yǎng)，避免種豬垂直傳播CSFV或PRRSV造成隱性感染豬只，再經(jīng)排毒感染其他健康豬群；飼養(yǎng)豬只全進(jìn)全出，避免交叉感染；待引進(jìn)豬只應(yīng)當(dāng)隔離飼養(yǎng)并做好疫病檢測工作，防止引入外來病原；定期開展血清學(xué)抗體監(jiān)測工作，對抗體水平不合格豬只及時補(bǔ)免，防止出現(xiàn)免疫空窗期。

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2016-10-22)

四川省科技支撐計劃(2014NZ0043)。

楊凡(1992-)，男，漢族，四川南充，在讀碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究。

徐志文，Tel： 13981604765；E-mail： abtcxzw@126.com。