王 巖，劉 洋，駱 翔，鄧意輝*

?

克里唑替尼脂質(zhì)體的制備與含量測定

王 巖1,2，劉 洋1，駱 翔1，鄧意輝1*

（1. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016；2. 沈陽市婦嬰醫(yī)院藥劑科，遼寧沈陽，110014）

目的制備克里唑替尼（crizotinib, CIB）脂質(zhì)體，并建立CIB的含量測定方法。方法采用pH梯度法制備克里唑替尼脂質(zhì)體（crizotinib liposomes, CIBL），以紫外分光光度法測定脂質(zhì)體中CIB的含量。結(jié)果實(shí)驗(yàn)條件下所用輔料對CIB的測定無干擾，CIB對照溶液的質(zhì)量濃度在15.0~35.0 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)=0.999 6，回收率在99.8%~101.2%內(nèi)，日內(nèi)及日間精密度RSD均小于2%（=3），制得CIBL的平均包封率為90.8%±1.11%。結(jié)論 pH梯度法可用于制備CIBL；紫外分光光度法測定CIB的含量簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于CIBL的含量測定。

藥劑學(xué)；脂質(zhì)體；pH梯度法；紫外分光光度法；克里唑替尼；含量測定

克里唑替尼（crizotinib，CIB，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）是包括間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）和肝細(xì)胞生長因子受體c-Met在內(nèi)的酪氨酸激酶受體抑制劑，其主要通過抑制細(xì)胞內(nèi)ALK和c-Met的磷酸化來發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[1]。由輝瑞公司研發(fā)的CIB膠囊（商品名 xalkori?）于2011年8月26日獲FDA批準(zhǔn)，用于治療ALK陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer）[2]。由于CIB吸收后在組織中廣泛分布，易引起視覺障礙、胃腸道等不良反應(yīng)，甚至?xí)鸩糠只颊叱霈F(xiàn)竇性心動(dòng)過緩、轉(zhuǎn)氨酶異常、中性粒細(xì)胞下降和呼吸困難等嚴(yán)重不良反應(yīng)，導(dǎo)致約29%~44%的患者須降低使用劑量，3%~6%的患者甚至放棄治療[1]。脂質(zhì)體具有延長藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、提高藥物靶向性、增強(qiáng)療效、降低毒性及不良反應(yīng)、提高被包封藥物穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。因此考慮將CIB包裹于脂質(zhì)體中，綜合利用實(shí)體瘤的高滲透長滯留EPR效應(yīng)及CIB的分子靶向性，達(dá)到提高療效、降低毒性及不良反應(yīng)的目的。到目前為止，國內(nèi)外尚無有關(guān)克里唑替尼脂質(zhì)體（crizotinib liposomes，CIBL）的研究報(bào)道。本文作者結(jié)合CIB兩親弱堿性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用pH梯度法制備CIBL，并采用紫外分光光度法對其含量進(jìn)行測定，該法方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。

Fig. 1 Chemical structure of crizotinib

1 儀器與材料

UV5100紫外可見分光光度計(jì)（安徽皖儀科技股份有限公司），VBS124s電子分析天平（德國賽多利斯公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），PHS-25酸度計(jì)（上海精科雷磁儀器廠），離心機(jī)（Anke TDL80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

克里唑替尼原料藥（CIB, 上海盛希醫(yī)藥原料有限公司，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98％），氫化大豆卵磷脂（ HSPC，德國Lucas meyer cosmetics公司），膽固醇（CH，南京新百藥業(yè)有限公司），聚乙二醇單甲醚2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE，美國Genzyme公司），離子交換纖維（ZB-1、ZB-2型，桂林正翰科技開發(fā)有限責(zé)任公司），-蘋果酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉（天津博迪化工股份有限公司），無水乙醇（徽安特生物化學(xué)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備[3]

取HSPC、CH及mPEG2000-DSPE（質(zhì)量比3∶1∶1），加入適量無水乙醇，于65 ℃水浴中攪拌溶解，揮去大部分乙醇后，注入濃度為300 mmol·L-1的檸檬酸鹽緩沖溶液（pH值為4.0），65 ℃水浴攪拌20 min。得到的脂質(zhì)體初品經(jīng)超聲處理，依次通過0.80、0.45、0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行整粒，得空白脂質(zhì)體。取上述空白脂質(zhì)體0.2 mL，加入陰陽離子交換纖維混合柱的頂端，2 000 r?min-1離心4 min；另取重蒸水0.1 mL，加入纖維柱頂端，2 000 r·min-1離心4 min，重復(fù)操作3次，合并洗脫液得到具有跨膜離子梯度的空白脂質(zhì)體，其中HSPC的質(zhì)量濃度為20 g·L-1。

精密稱取CIB 40.0 mg、蘋果酸24.0 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得4 g·L-1CIB水溶液。

取梯度脂質(zhì)體1.0 mL，按藥脂質(zhì)量比1∶10加入4 g·L-1CIB水溶液0.5 mL，于60 ℃水浴中攪拌孵育10 min后，加入500 mol·L-1磷酸鈉溶液40 μL，調(diào)節(jié)外水相pH值至7，繼續(xù)磁力攪拌15 min，冰水浴終止載藥，即得克里唑替尼脂質(zhì)體（crizotinib liposomes，CIBL），其中CIB的質(zhì)量濃度為1.3 g·L-1。

2.2 脂質(zhì)體中CIB含量測定方法的建立

2.2.1 對照溶液的配制

精密稱取CIB 25.0 mg、蘋果酸15.0 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1.00 mL，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）稀釋至25 mL，得質(zhì)量濃度為100 mg·L-1對照儲(chǔ)備液。精密量取上述儲(chǔ)備液2.50 mL，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）稀釋至10 mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為25.0 mg·L-1的對照溶液。

2.2.2 空白溶液的配制

精密量取空白脂質(zhì)體50 μL置于10 mL量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）稀釋至刻度，搖勻，即得空白溶液。

2.2.3 供試溶液的配制

精密量取CIBL 0.20 mL置于10 mL量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為26.0 mg·L-1的供試溶液。

2.2.4 檢測波長的選擇

在波長200～500 nm內(nèi)，對“2.2”條下空白溶液和對照溶液進(jìn)行紫外掃描（圖2），結(jié)果表明CIB分別在284 nm和336 nm處有最大吸收，且空白脂質(zhì)體無干擾。由于284 nm處所測吸光度值穩(wěn)定性不好，因此確定336 nm為檢測波長。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取100 mg·L-1的CIB對照儲(chǔ)備液1.50、2.00、2.50、3.00和3.50 mL置于10 mL量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為15.0、20.0、25.0、30.0和35.0 mg·L-1的對照溶液，于波長336 nm處分別測定其吸光度（），得線性回歸方程=1.82×10-2+1.90×10-2（= 0.999 6）。說明CIB質(zhì)量濃度在15.0～35.0 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度與重復(fù)性試驗(yàn)

分別取“2. 3”條下質(zhì)量濃度為15.0、25.0和35.0 mg·L-1的CIB對照溶液，于0、2、4、6、8和12 h進(jìn)行吸光度測定。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度的RSD分別為0.80%、0.79%和0.74%；并于12、24、36、48和60 h內(nèi)測定日間精密度，其RSD分別為0.85%、0.72%和0.74%。日內(nèi)和日間精密度的RSD均＜2%，表明該方法精密度良好。

取CIBL適量，按“2.2.3”條方法平行制備5份供試溶液，進(jìn)行測定，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CIB含量的RSD為1.09%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

精密量取100 mg·L-1的CIB對照儲(chǔ)備液1.50、2.50和3.50 mL各3份，加入相應(yīng)處方量的空白脂質(zhì)體，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）稀釋至10 mL，搖勻，配制成CIB質(zhì)量濃度分別為15.0、25.0和35.0 mg·L-1的低、中、高供試溶液，測定吸光度并代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得測定質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

Table 1 Results of recovery test for CIB in liposome (n=3)

2.6 脂質(zhì)體中CIB的含量測定

取3批CIBL樣品，按“2.2.3”條方法制備供試溶液，進(jìn)行測定。另取CIB對照溶液，同法測定。按外標(biāo)法計(jì)算，得3批供試品含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.86%、100.16%和100.32%。

2.7 脂質(zhì)體包封率的測定

采用已建立的陽離子交換纖維分離-紫外分光光度法測定CIBL的包封率[4]，其中陽離子交換纖維對脂質(zhì)體與藥物溶液達(dá)到了完全分離。分別精密量取CIBL 0.20 mL 2份，一份加入重蒸水1.6 mL，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）溶解并稀釋至10 mL，搖勻，于波長336 nm下測定吸光度并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得脂質(zhì)體中CIB總質(zhì)量濃度(0)。另一份置于陽離子交換纖維微柱頂端，2 000 r·min-1離心4 min，再于柱頂端加入重蒸水0.4 mL，2 000 r·min-1離心4 min，重復(fù)操作3次。將上述4次的洗脫液合并置于10 mL量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol?L-1鹽酸）溶解并稀釋至刻度，搖勻，測定吸光度，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得脂質(zhì)體中CIB總濃度(1)。包封率(%)=（1/0）×100%。測得所制備的3批CIBL的包封率分別為91.6%、91.2%和89.5%，平均包封率為90.8%±1.11%。

3 討論

a. pH梯度載藥法是在脂質(zhì)體內(nèi)外水相建立H+梯度，使弱堿性藥物以中性的分子形式沿濃度梯度擴(kuò)散進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)部，隨后發(fā)生質(zhì)子化并滯留在內(nèi)水相。pH梯度法用于阿霉素（兩親性弱堿，pKa為8.6）脂質(zhì)體的制備，使阿霉素脂質(zhì)體的包封率由被動(dòng)載藥法的不到10%[5]提高至98%以上[6]，現(xiàn)已有產(chǎn)品（Myocetò）上市[7]。CIB為兩親性弱堿類藥物，其pKa1為5.6、pKa2為9.4，作者采用pH梯度法制備克里唑替尼脂質(zhì)體，包封率可達(dá)到90%左右。

b. 脂質(zhì)體中游離藥物的分離方法很多[8]，如透析法、高速離心法、葡聚糖凝膠過濾法等，但這些方法存在費(fèi)用高、操作繁瑣等不足。Luo等[9]采用陽離子交換纖維有效分離游離的鹽酸小檗堿和脂質(zhì)體，楊強(qiáng)等[4]采用陽離子交換纖維分離游離的表阿霉素和脂質(zhì)體，并認(rèn)為與傳統(tǒng)的離子交換樹脂相比，離子交換纖維具有外比表面積大、交換速度快、滲透壓穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，作者選擇采用陽離子交換纖維法，達(dá)到了完全分離游離CIB與脂質(zhì)體的效果。

c. 作者建立紫外分光光度法測定脂質(zhì)體中CIB含量的方法。因CIB在波長336 nm有吸收峰，而空白脂質(zhì)體在此波長處無吸收，對測定無干擾。而且該法具有操作簡便、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為制劑的質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量控制提供了可靠依據(jù)。

[1] 劉春花, 宋勇. 克里唑替尼在非小細(xì)胞癌治療中的研究進(jìn)展[J]. 中國肺部疾病雜志: 電子版, 2014, 7(1): 78-80.

[2]CAMIDGE D R, BANG Y, KWAK E L, et al. Progression-free survival (PFS) from a phase I study of crizotinib (PF-02341066) in patients with ALK-positive non-small cell lung cancer (NSCLC)[J]. J Clin Oncol, 2010, 29(Suppl 15): 2696-2696.

[3] 何琳, 李哲, 馬艷鈴, 等. 吉非替尼脂質(zhì)體的制備及含量測定[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 29(1): 1-4.

[4] 楊強(qiáng), 張巖柏, 牟麗娜, 等. 陽離子交換纖維微柱離心法測定鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體包封率[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 28(11): 853-856.

[5] MAYER L D, TAI L C L, BALLY M B, et al: Characterization of liposomal systems containing doxorubicin entrapped in response to pH gradients[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1990, 1025: 143-151.

[6] 鄧意輝, 于彬. pH 梯度法制備阿霉素脂質(zhì)體[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 1997, 14(4): 239-242.

[7] CHO K, WANG X U, NIE S, et al. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer[J]. Clinical Cancer Research, 2008, 14(5): 1310-1316.

[8]TORCHILIN V P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4(2): 145-160.

[9] LUO X, LI J, GUO L, et al. Preparation of berberine hydrochloride long-circulating liposomes by ionophore A23187-mediated ZnSO 4 gradient method[J]. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 8(4): 261-266.

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

Preparation of crizotinib liposomes and determination of its content

WANG Yan1,2，LIU Yang1，LUO Xiang1，DENG Yi-hui1*

(1.,,110016,; 2.,110014,)

Objective Toprepare crizotinib (CIB) liposomes and establish a method for determination of its content. Methods Crizotinib liposomes were prepared by pH gradient method. Ultraviolet spectrophotometry was used to determine its content with the detection wavelength of 336 nm. Results Adjuvants used under the experiment conditions did not interfere with the determination results of CIB. CIB had a good linear relationship over the range of 15.0-35.0 mg·L-1(=0.999 6), the recovery was in a range of 99.8%-101.2%, the intra-day RSD and inter-day RSD were less than 2%（=3）. The average entrapment efficiency of CIB liposomes were 90.8% ±1.11%. Conclusions pH gradient method could be used to prepare CIB liposomes. It is a simple and accurate method to determine the content of CIB in the liposmes by ultraviolet spectrophotometry.

pharmaceutics; liposome; pH gradient; ultraviolet spectrophotometry; crizotinib; content determination

（2017）01–0008–05

10.14146/j.cnki.cjp.2017.01.002

R943

A

2015-05-28

王巖(1978-), 女(漢族), 遼寧朝陽人, 碩士研究生, E-mailwangyan992502@163.com;

鄧意輝(1964-), 男(漢族), 湖南花垣人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物靶向新劑型的研究, Tel. 024-23986316,E-mail dds-666@163.com。