劉 明，宣振華，張永萍#，劉 毅，劉 莉，王海洋（1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 55005；.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 55005；.貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)股份有限公司，貴陽(yáng) 55000）

杜仲壯骨丸對(duì)維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松的改善作用Δ

劉 明1＊，宣振華2，張永萍2#，劉 毅2，劉 莉3，王海洋3（1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3.貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)股份有限公司，貴陽(yáng) 550002）

目的：考察杜仲壯骨丸（DZ）對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松的改善作用。方法：將72只KM小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（仙靈骨葆膠囊，0.50 g/kg）和DZ高、中、低劑量組（1.90、0.95、0.48 g/kg，記為DZ-H、DZ-M、DZ-L組），每組12只。除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠均ig維甲酸復(fù)制骨質(zhì)疏松模型，并同時(shí)ig相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥后，測(cè)定小鼠體質(zhì)量；摘眼球取血測(cè)定血清鈣、血清磷含量；取肝、脾、胸腺測(cè)定臟器指數(shù)；取左側(cè)股骨測(cè)定骨濕質(zhì)量、干質(zhì)量、長(zhǎng)度和直徑；取右側(cè)股骨測(cè)定骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數(shù)目。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量降低；血清鈣、血清磷含量增加；肝指數(shù)、脾指數(shù)升高，胸腺指數(shù)降低；股骨濕、干質(zhì)量及直徑減少；骨小梁面積百分比降低，骨小梁寬度及數(shù)目減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血清鈣含量減少，陽(yáng)性對(duì)照組和DZ-M、DZ-L組小鼠血清磷含量減少；陽(yáng)性對(duì)照組和DZ-M、DZ-L組小鼠胸腺指數(shù)升高，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)降低；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的股骨濕質(zhì)量及DZ-M組小鼠股骨干、濕質(zhì)量和直徑均增加；陽(yáng)性對(duì)照組和DZ-H、DZ-M組小鼠股骨骨小梁百分比升高，骨小梁寬度及骨小梁數(shù)目均增加，且DZ-L組小鼠骨小梁數(shù)目增加，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：DZ對(duì)維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松具有一定的改善作用。

杜仲壯骨丸；維甲酸；骨質(zhì)疏松模型；小鼠；股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)

維甲酸（Retinoic acid）是一種免疫抑制劑，由于其具有抑制骨合成的作用，近年來(lái)常被用來(lái)建立動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型[1]。杜仲壯骨丸（DZ）是貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)有限公司獨(dú)家專(zhuān)利品種（國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)為Z52020210），臨床主要用于治療風(fēng)濕痹痛、筋骨無(wú)力等癥。本品臨床應(yīng)用多年，具有堅(jiān)實(shí)的臨床基礎(chǔ)，但由于處方中含有豹骨和尋骨風(fēng)2味藥材，其中豹骨屬于瀕危保護(hù)動(dòng)物藥材，尋骨風(fēng)由于含有馬兜鈴酸，長(zhǎng)期大量應(yīng)用可引起一定程度的腎損害。因此，本課題組在對(duì)這2味藥材進(jìn)行減去或替代（即去掉豹骨，另用腫節(jié)風(fēng)代替尋骨風(fēng)，然后按照原制備工藝制備）研究的基礎(chǔ)上，采用維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松，觀察改進(jìn)后的DZ對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松的改善作用，以擴(kuò)大其臨床適應(yīng)證。

1 材料

1.1 儀器

752紫外光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠(chǎng)）；TGL-12GB-C臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；BX51T-PHD-J11系統(tǒng)相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)（美國(guó)Media Cybernetics公司）。

1.2 藥品與試劑

DZ（貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130906，規(guī)格：0.19 g/丸）；仙靈骨葆膠囊（貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，批號(hào)：20130217，規(guī)格：每粒0.5 g）；維甲酸原料藥（全反式，重慶華邦制藥股份有限公司，批號(hào)：20130425）；血清鈣、磷試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140327、20140329）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠72只，♀♂各半，體質(zhì)量24～28 g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（黔）2012-001]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將72只KM小鼠隨機(jī)分成6組，分別為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（仙靈骨葆膠囊，0.50 g/kg，相當(dāng)于人臨床用量的10倍劑量）和杜仲壯骨丸高、中、低劑量組（1.90、0.95、0.48 g/kg，分別相當(dāng)于人臨床用量的20、10、5倍劑量，分別記為DZ-H、DZ-M、DZ-L組），每組12只。除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠每天上午按105 mg/kg劑量ig維甲酸相應(yīng)溶液1次，連續(xù)14 d，復(fù)制骨質(zhì)疏松模型[2]。造模同時(shí)，各給藥組小鼠每天下午ig相應(yīng)藥物，給藥體積均為0.2 mL/10 g（均以生理鹽水為溶劑），每天1次，連續(xù)14 d；空白對(duì)照組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周稱(chēng)小鼠體質(zhì)量1次。

2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

[3-6]中方法進(jìn)行標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)。

2.2.1 血清鈣、血清磷含量及重要臟器指數(shù) 于實(shí)驗(yàn)第15天摘眼球取血，以1 000×g離心15 min，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清鈣、血清磷含量。取血完成后處死小鼠，取肝、脾、胸腺，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)（mg/g）＝臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.2.2 骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數(shù)目 取右側(cè)股骨，中性福爾馬林浸泡，常規(guī)脫鈣，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，通過(guò)多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及骨小梁數(shù)目進(jìn)行分析。

2.2.3 股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo) 取左側(cè)股骨，除凈附著的軟組織，測(cè)定股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)。（1）股骨濕質(zhì)量：用電子天平稱(chēng)量，得股骨濕質(zhì)量（mg）；（2）股骨長(zhǎng)度：用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，得股骨長(zhǎng)度（mm）；（3）股骨直徑：分別于股骨的近端1/3點(diǎn)、中點(diǎn)、遠(yuǎn)端1/3點(diǎn)，用游標(biāo)卡尺量取最大外徑及最小外徑，取6個(gè)值的平均值，得股骨直徑（mm）；（4）股骨干質(zhì)量：將股骨在80℃條件下烘干至恒質(zhì)量，得股骨干質(zhì)量（mg）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用s表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DZ對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠血清鈣、血清磷含量的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清鈣、血清磷含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清鈣、血清磷含量均不同程度地降低，除DZ-H組小鼠血清磷含量降低不顯著外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清鈣、血清磷含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The serum calcium and serum phosphorus content of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠血清鈣、血清磷含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The serum calcium and serum phosphorus content of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組血清磷，mmol/L 2.778±0.756 3.663±0.895＊2.778±0.399##3.173±0.771 3.034±0.707#2.977±0.562#劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48血清鈣，mmol/L 1.964±0.305 2.439±0.674＊1.994±0.254#1.984±0.368#1.998±0.182#2.031±0.125#

3.2 DZ對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠體質(zhì)量及重要臟器指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)降低（P＜0.05或P＜0.01），肝指數(shù)和脾指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和DZ-M、DZ-L組小鼠胸腺指數(shù)升高（P＜0.05或P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝指數(shù)降低（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 DZ對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨骨小梁的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠股骨骨小梁面積百分比降低（P＜0.01），骨小梁寬度和數(shù)目減少（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組上述指標(biāo)均得到不同程度改善，除DZ-L組小鼠股骨骨小梁面積百分比和骨小梁寬度變化不顯著外，其余各組上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。

3.4 DZ對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

表2 各組小鼠體質(zhì)量及胸、肝、脾指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 The wight and thymus，liver and spleen indexes of mice in each group（±s，n＝12）

表2 各組小鼠體質(zhì)量及胸、肝、脾指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 The wight and thymus，liver and spleen indexes of mice in each group（±s，n＝12）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48體質(zhì)量，g 33.3±2.9 29.9±3.9＊29.8±3.7 28.9±3.3 28.7±3.8 30.2±4.1脾指數(shù)，mg/g 3.2±0.5 3.9±0.9＊3.4±0.7 3.5±0.9 3.7±0.8 3.9±0.8胸腺指數(shù)，mg/g 3.8±0.7 2.9±0.5＊＊3.4±0.6#3.1±0.6 3.5±1.0#3.3±0.6#肝指數(shù)，mg/g 43.5±4.0 47.8±4.3＊43.9±6.1#44.9±5.6 46.6±4.6 48.6±5.5

圖1 各組小鼠股骨病理切片圖（HE染色，×100）Fig 1 Pathological sections of femour of mice in each group（HE staining，×100）

表3 各組小鼠股骨骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數(shù)目測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 3 The area percentage，width and number of bone trabecula of femur of mice in each group（±s，n＝8）

表3 各組小鼠股骨骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數(shù)目測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 3 The area percentage，width and number of bone trabecula of femur of mice in each group（±s，n＝8）

注：與空白對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組骨小梁數(shù)目，個(gè)/mm 8.8±1.8 2.3±0.7＊＊5.3±1.2##6.1±1.6##5.4±1.7##3.3±0.9#劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48骨小梁面積百分比，% 31.8±8.1 5.1±1.4＊＊17.9±7.1##20.7±9.8##15.8±6.1##5.1±1.7骨小梁寬度，μm 41.7±9.9 10.3±2.8＊＊25.2±7.7##28.7±16.8##14.9±4.8#12.8±8.2

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠股骨濕質(zhì)量、干質(zhì)量降低（P＜0.05或P＜0.01），股骨直徑減少（P＜0.05），股骨長(zhǎng)度無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和DZ-M組小鼠股骨濕質(zhì)量增加（P＜0.05），DZ-M組小鼠股骨干質(zhì)量和股骨直徑增加（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)

表4 。表4 各組小鼠股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 4 The metrology index of femur in mice in each group（±s，n＝12）

表4 。表4 各組小鼠股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 4 The metrology index of femur in mice in each group（±s，n＝12）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組股骨直徑，mm 1.77±0.09 1.66±0.13＊1.74±0.13 1.72±0.09 1.74±0.09#1.66±0.13劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48股骨濕質(zhì)量，mg 56.0±5.9 48.5±6.4＊＊54.0±8.0#50.5±5.5 54.2±7.7#49.8±5.5股骨干質(zhì)量，mg 36.2±6.5 30.8±4.6＊33.5±6.0 33.2±6.6 35.1±6.1#32.3±5.4股骨長(zhǎng)度，mm 13.3±0.5 13.1±0.4 13.3±0.6 13.3±0.8 13.2±0.5 13.4±0.6

4 討論

骨質(zhì)疏松是一種骨代謝性疾病，表現(xiàn)為骨密度降低，骨礦元素含量減少，骨小梁變細(xì)、數(shù)目變少，骨脆性增加，骨折危險(xiǎn)性加大等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松是機(jī)體在生理老化基礎(chǔ)上由遺傳及環(huán)境等多種因素共同作用的結(jié)果，骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的主要原因是雌激素缺乏和鈣攝入量不足，以致骨吸收大于骨形成[7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松屬于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇，其發(fā)生首先當(dāng)責(zé)之于腎虛精虧，多采用補(bǔ)腎填精壯骨之法治療[8-9]。在進(jìn)行維甲酸致骨質(zhì)疏松動(dòng)物研究時(shí)，多選擇鈣劑、維生素D等作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，但也有研究者選擇中成藥（如仙靈骨葆膠囊）[10]，且仙靈骨葆膠囊已成為臨床上治療骨質(zhì)疏松的重要中成藥。

小鼠按105 mg/kg劑量連續(xù)給予維甲酸14 d后，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)顯著降低，這提示維甲酸對(duì)小鼠有一定的免疫抑制作用；股骨干、濕質(zhì)量均顯著減輕，股骨直徑顯著減少，這提示維甲酸對(duì)于小鼠骨生長(zhǎng)具有明顯抑制作用；血清鈣、血清磷含量升高，這提示維甲酸可誘導(dǎo)骨代謝活躍、骨轉(zhuǎn)換率升高；股骨病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠股骨骨小梁稀疏、變細(xì)、斷裂、排列紊亂，骨小梁面積百分比、寬度、數(shù)目均減少，這進(jìn)一步表明其可抑制骨形成，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。給予DZ后，小鼠體質(zhì)量雖未見(jiàn)明顯恢復(fù)，但重要臟器指數(shù)卻得到不同程度改善，股骨干、濕質(zhì)量及股骨直徑均增加，血清鈣、磷含量顯著降低，骨小梁面積百分比、寬度、數(shù)目均增加，這提示DZ能夠有效地增強(qiáng)免疫，促進(jìn)骨生長(zhǎng)趨于正常，抑制血鈣、血磷流失，促進(jìn)骨鈣、骨磷吸收，對(duì)于骨質(zhì)疏松具有明顯的改善作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DZ-H組小鼠的指標(biāo)變化不如中、低劑量組，其原因可能是高劑量組給藥劑量較大，藥物吸收不完全，或者是因劑量較大，藥物成分間相互影響所致。在實(shí)驗(yàn)中，因每組均有個(gè)別血清樣本出現(xiàn)溶血或血量過(guò)少的情況，故每組均隨機(jī)選擇10個(gè)血液樣本進(jìn)行血清鈣、磷的測(cè)定；病理檢測(cè)則每組隨機(jī)選擇8個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，DZ ig給藥后對(duì)維甲酸致小鼠實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松有明顯的改善作用，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Improvement Effect of Duzhong Zhuanggu Pills on Retinoic Acid-induced Osteoporosis in Mice

LIU Ming1，XUAN Zhenhua2，ZHANG Yongping2，LIU Yi2，LIU Li3，WANG Haiyang3（1.School of Basic Medicine，Guiyang University of Chinese Medicine，Guiyang 550025，China；2.School of Pharmacy，Guiyang University of Chinese Medicine，Guiyang 550025，China；3.Guiyang Dechangxiang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang 550002，China）

OBJECTIVE：To investigate improvement effect of Duzhong zhuanggu（DZ）pills on retinoic acid-induced osteoporosis in mice.METHODS：72 KM mice were randomized into blank control group（normal saline），model group（normal saline），positive control group（Xianling gubao capsule，0.50 g/kg），DZ pills high-dose，medium-dose and low-dose groups（1.90，0.95，0.48 g/kg，DZ-H，DZ-M，DZ-L groups），with 12 mice in each group.Except for blank control group，other groups were given retinoic acid intragastrically to induce osteoporosis model，and given relevant medicine intragastrically once a day，for 14 days.After last administration，body weight of mice was determined；the blood sample was collected from eyeball to determine the contents of serum calcium and phosphor；liver，spleen and thymus gland were collected to determine organ index；left femur was collected to determine bone wet weight，bone dry weight，length and diameter；right femur was collected to determine the area percentage，width and number of bone trabecula.RESULTS：Compared with blank control group，the body weight of mice in model group were decreased；the contents of serum calcium and phosphorus were increased；liver indexes and spleen indexes were increased，while thymus indexes were decreased；bone wet weight，bone dry weight，length and diameter were decreased；area percentage，width and number of trabecular were decreased，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，the contents of serum calcium were decreased in treatment groups，and the contents of serum phosphorus were decreased in positive control group，DZ-M and DZ-L groups.Thymus indexes were increased in positive control group，DZ-M and DZ-L groups，while liver indexes were decreased in positive control group；femur wet weight of positive control group as well as femur dry and wet weight，diameters of DZ-M were all increased.The percentage，width and number of bone trabecula were increased in positive control group，DZ-H and DZ-M group，and the number of bone trabecula was increased in DZ-L group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：DZ pills have improvement effect on osteoporosis induced by retinoic acid in mice.

Duzhong zhuanggu pills；Retinoic acid；Osteoporosis model；Mice；Metrology index of femur

R285.5

A

1001-0408（2017）01-0035-04DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.09

2016-07-04

2016-10-16）

（編輯：林 靜）

貴州省科技計(jì)劃子課題（No.黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字〔2012〕6009號(hào)）

＊副教授，博士。研究方向：中藥、民族藥防治心腦血管疾病藥理。電話(huà)：0851-88308013。E-mail：393617518@qq.com

#通信作者：教授。研究方向：中藥新制劑。E-mail：642055255 @qq.com