萜類化合物的合成生物學(xué)研究進(jìn)展

孫麗超 李淑英 王鳳忠 辛鳳姣（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

萜類化合物的合成生物學(xué)研究進(jìn)展

孫麗超 李淑英 王鳳忠 辛鳳姣
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

萜類化合物是種類最多的一類天然產(chǎn)物，具有抗癌、抗過敏等多種生物活性，在食品、日化、醫(yī)療等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的市場前景。近年來，研究人員采用功能基因組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)對不同萜類的合成途徑進(jìn)行了深入研究，為萜類的合成生物學(xué)研究提供了大量的數(shù)據(jù)支撐。目前，已經(jīng)通過合成生物學(xué)方法構(gòu)建出萜類高產(chǎn)的酵母工程菌株，實(shí)現(xiàn)了多種目標(biāo)產(chǎn)物的高效生產(chǎn)，有效提高了萜類的總體生產(chǎn)水平。因此，采用合成生物學(xué)策略合成萜類化合物，有望成為植物源萜類生產(chǎn)的有效技術(shù)手段。首先介紹了合成生物學(xué)概念，進(jìn)而總結(jié)了植物源萜類的重要功能和應(yīng)用領(lǐng)域，并簡述了不同萜類的合成途徑，歸納了現(xiàn)有的萜類生產(chǎn)方式，然后深入探討了萜類生物合成的設(shè)計(jì)策略，最后以幾種常見的萜類為例，詳細(xì)論述了不同萜類的合成生物學(xué)的研究進(jìn)展。

萜類化合物；生物合成；萜類合成設(shè)計(jì)；合成生物學(xué)進(jìn)展

合成生物學(xué)是21世紀(jì)新興的一門學(xué)科，結(jié)合了傳統(tǒng)的代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)概念，旨在建立人工生物系統(tǒng)，將基因連接成網(wǎng)絡(luò)，使微生物底盤細(xì)胞完成設(shè)計(jì)人員設(shè)想的各種任務(wù)，具體過程包括底盤細(xì)胞的構(gòu)建、合成元件的挖掘、合成途徑的設(shè)計(jì)以及細(xì)胞合成工廠的創(chuàng)建［1］。微生物具有生長代謝速率高、培養(yǎng)條件封閉易控制、多種營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記便于基因編輯操作、可通過生化反應(yīng)器放大規(guī)模等諸多特點(diǎn)，選擇其作為底盤細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu)勢。目前通常采用質(zhì)譜、LC-MS、GC-MS及核磁共振技術(shù)，通過將合成產(chǎn)物與天然產(chǎn)物進(jìn)行比較的方法，檢測合成產(chǎn)物的質(zhì)量。采用合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)目的產(chǎn)物具有穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此，該技術(shù)既被用來模擬已有生物元件及合成途徑生產(chǎn)天然產(chǎn)物，也被用于生產(chǎn)制造各種化學(xué)品和燃料，甚至還被用于設(shè)計(jì)、合成新型非天然藥物。

近年來，國家對生物制造業(yè)給予了大力支持，我國合成生物學(xué)的發(fā)展如火如荼。以中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所馬延和為首席的“人工合成細(xì)胞工廠”“973項(xiàng)目”，圍繞著大腸桿菌及光合藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行了大量研究，通過光合模塊和CO2固定實(shí)現(xiàn)了從CO2到酮、醇及酸等化學(xué)品的生物合成［2］。北京化工大學(xué)袁其朋團(tuán)隊(duì)以大腸桿菌作為底盤細(xì)胞，經(jīng)莽草酸途徑合成了3-苯基丙酸、3-（4-）羥基丙酸以及4-羥基香豆素等多種芳香族化合物［3］。以清華大學(xué)陳國強(qiáng)為首席的“973項(xiàng)目”則以嗜鹽單胞菌為對象，實(shí)現(xiàn)了聚羥基脂肪酸（polyhydroxyalkanoates，PHA）等高分子材料、化學(xué)品和燃料的生物制造［4，5］。以中國科學(xué)院微生物研究所張立新為首席的“合成微生物體系的適配性研究”“973項(xiàng)目”，則以大腸桿菌和鏈霉菌作為底盤細(xì)胞，生產(chǎn)微生物藥物阿維菌素、聚酮類藥物及核苷肽類藥物等［6］。上海交通大學(xué)許平團(tuán)隊(duì)則開展了大量關(guān)于天然食品添加劑的生物合成學(xué)研究，采用自養(yǎng)光合菌如假單胞菌合成多元醇類生物香料、利用藍(lán)藻生產(chǎn)乳酸、通過聚球藻生產(chǎn)苯丙烷類等高值化合物，實(shí)現(xiàn)了多種天然生物香料和藥用谷氨酰胺的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)［7，8］。中國科學(xué)院院士鄧子新提倡挖掘基因組“Dark holes”，帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)以深海、極地等極端環(huán)境微生物以及動植物共生生物為研究對象，克隆鑒定多種抗生素基因簇，開展關(guān)于非天然抗生素藥物的合成生物學(xué)研究，獲得了大量新型抗生素衍生物，顯著推動了我國微生物藥物生物合成領(lǐng)域的發(fā)展［9］。隨著合成生物學(xué)的不斷發(fā)展和完善，該學(xué)科將為能源、材料、醫(yī)藥、食品、日化等行業(yè)提供更多的產(chǎn)品支撐。

1 萜類化合物的合成生物學(xué)研究

1.1 萜類化合物的種類及其應(yīng)用

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物（isoprenoids），主要從植物、微生物及海洋生物中分離得到。萜類通式是（C5H8）n（n是異戊二烯的單元數(shù)）。根據(jù)n的數(shù)目，萜類化合物可分為半萜（C5）、單萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）、二倍半萜（C25）、三萜（C30）、四萜（C40）和多萜（n＞C40）［10］。目前發(fā)現(xiàn)的萜類超過5萬多種，常見的有單萜薄荷醇（menthol）、倍半萜青蒿素（artemisinin）、二萜紫杉醇（taxol）、三萜人參皂苷（ginsenoside）、四萜類胡蘿卜素化合物（carotenoids）等。

萜類有著重要的生物學(xué)功能和應(yīng)用價值，見表1?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，很多萜類都具有廣泛的抗癌功效［11］。來源于真菌屬月光菌的倍半萜隱杯傘素S（illudin S）及其類似物伊洛福芬（irufloven）能夠有效抑制轉(zhuǎn)移性腎癌中的DNA合成［12］。紅豆杉屬植物中的三環(huán)二萜化合物紫杉醇對卵巢癌和乳腺癌有明顯的療效［13］。葫蘆科來源的三萜化合物葫蘆素（cucurbitacin）能夠抑制癌細(xì)胞的生長，可與其他抗癌藥物一起用于癌癥治療。其中，葫蘆素E具有抑制癌細(xì)胞增殖的功能，該結(jié)果已在膀胱癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌及白血病中得到證實(shí)［14，15］。葫蘆素B除了被證實(shí)具有抑菌和消炎活性，還能夠抑制人類惡性腫瘤細(xì)胞的生長，包括乳癌細(xì)胞、頭頸部鱗癌、胰腺癌、肝癌、骨肉瘤和骨髓性白血?。?6-18］。截至目前，已有多種葫蘆科植物來源的葫蘆素及葫蘆素衍生物被分離出來［19］。

萜類還具有消炎、降糖等廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，三萜皂苷類能夠消炎、抗過敏、治療白血病、抗病毒、降血糖以及防治心腦血管疾病等［20］。2013年，人參皂苷化合物K（compound K，CK）被我國藥監(jiān)局批準(zhǔn)為防治關(guān)節(jié)炎的臨床用藥（CDEL20130379）。Yan等［21］發(fā)現(xiàn)CK是三萜皂苷在哺乳動物血液和器官中發(fā)揮消炎、保肝、降糖及抗癌等功效的主要組分。來源于菊科植物（俗稱青蒿）的倍半萜內(nèi)酯衍生物青蒿素不僅能夠抗癌、消炎，還被發(fā)現(xiàn)是一種非常強(qiáng)大的抗瘧疾藥物，且不與其他抗瘧藥產(chǎn)生交叉耐藥性［22］。四萜化合物番茄紅素（lycopene）是類胡蘿卜素的一種，存在于番茄、西瓜、葡萄柚等的果實(shí)中，是一種很強(qiáng)的食用抗氧化劑，能夠有效抑制脂質(zhì)的氧化，清除羥自由基。流行病學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，食用番茄紅素不僅能夠防治前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌、膀胱癌、口腔癌、食道癌、胃癌、直腸癌及胰腺癌，還具有預(yù)防心腦血管疾病、延緩衰老等功效［23，24］。

此外，很多植物源萜類化合物是芳香性揮發(fā)性物質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于香料、香水、調(diào)味劑及化妝品等行業(yè)［25］。諾卡酮（nootkatone）、紫蘇醇（sclareol）、薄荷醇（menthol）及芳樟醇（linalool）等芳香萜類是植物性精油的重要組成成分，也是果實(shí)芳香和植物花香等的氣味來源，因此是芳香食品和精油類化妝品中常用的香料［26］。

很多萜類是植物與昆蟲協(xié)同進(jìn)化過程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，能夠吸引傳粉動物輔助植物授粉，抑或?qū)ハx有拒食作用，幫助植物抵御蟲害和病原微生物，因此常被用于農(nóng)藥中［27］。一些單萜如檸檬烯（limonene）和香葉烯（myrcene）均有很好的殺蟲性，一些單萜烯類的衍生物如除蟲菊酯（pyrethrin）則是非常高效的植物性殺蟲劑［28］。一些三萜如檸檬苦素類化合物（limonoids）也是很強(qiáng)的昆蟲防御劑，被用作農(nóng)作物的防蟲害劑。其他三萜類化合物，如葫蘆素C、二萜水蓼二醛（polygodial）均參與了植物的抗蟲功能［29，30］。

萜類結(jié)構(gòu)的多樣性還使得其成為汽油、柴油等燃料的高級替代物。事實(shí)上，倍半萜法尼烯（farnesene）和紅沒藥烯（bisabolene），單萜蒎烯（pinene）和檸檬烯，半萜異戊烯醇（isopentenol）和異戊醇（isopentanol）均是公認(rèn)的燃料及燃料的前體物［31］。

表1 萜類化合物的功能與應(yīng)用

1.2 萜類化合物的合成

1.2.1 萜類的生物合成途徑 植物源萜類化合物是植物中結(jié)構(gòu)變化種類最多的一類天然產(chǎn)物，其在生物體中的合成可以由異戊二烯首尾相接，也可以通過異戊二烯成環(huán)形成［32］。異戊二烯首先需要通過活化轉(zhuǎn)化成異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP）。生物體內(nèi)IPP和DMAPP的合成存在兩種途徑：由3個乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）形成的甲羥戊酸（mevalonate acid-dependent，MEV）途徑以及由丙酮酸（pyruvate）或3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate，G-3-P）縮合形成的甲基赤蘚醇（2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP/deoxyxylulose 5-phosphate，DXP）途徑，不同途徑的選擇取決于生物的種類以及合成產(chǎn)物的亞細(xì)胞空間位置［33］。植物采用MEV和MEP/ DXP兩種途徑來合成IPP和DMAPP（圖1）。其中，MEV途徑主要用于植物細(xì)胞質(zhì)中的倍半萜、三萜及多萜的合成，MEP/DXP途徑主要用于植物質(zhì)體中的單萜、二萜和四萜的合成［34，35］。除了植物以外的其他真核生物均采用MEV合成IPP，并在IPP異構(gòu)酶的作用下生成DMAPP。原核生物則主要通過MEP/DXP途徑將G-3-P轉(zhuǎn)變成IPP和DMAPP［36］。

圖1 植物源萜類的生物合成途徑

IPP和DMAPP是所有萜類的共同前體，一分子DMAPP和不同分子數(shù)的IPP在異戊烯轉(zhuǎn)移酶（prenyltransferase）的作用下會進(jìn)一步生成不同的萜類前體［37］。這些前體在各種萜類合酶（terpene synthases，TPS）的作用下會被合成種類各異的萜類骨架，因此，萜類合酶是不同萜類合成過程中的關(guān)鍵因子［38］。不同萜類的合成途徑如圖1所示，具體如下：（1）單萜：一分子IPP和一分子DMAPP能夠生成牻牛兒基焦磷酸（greanyl diphosphate，GPP）或橙花基焦磷酸（neryl diphosphate，NPP），GPP是無環(huán)單萜前體，NPP是單環(huán)單萜前體，它們在單萜合酶的催化下合成不同的單萜，如GPP在香葉醇合成酶的催化下能夠產(chǎn)生無環(huán)單萜香葉醇（geraniol）；NPP在檸檬烯合酶（limonene synthase，LS）的催化下則會合成單環(huán)單萜骨架檸檬烯（limonene），并進(jìn)一步經(jīng)過氧化還原作用等反應(yīng)合成單萜薄荷醇。（2）倍半萜：兩分子IPP和一分子DMAPP生成倍半萜前體法呢基焦磷酸（fanesyl diphosphate，F(xiàn)PP），其在倍半萜合酶如紫穗槐-4，11-二烯合酶（amorpha-4，11-diene synthase，ADS）的催化下生成青蒿素的前體紫穗槐二烯（amorphadiene）。（3）二萜：三分子IPP和一分子DMAPP產(chǎn)生二萜的前體牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（greanylgeranyl diphosphate，GGPP），其在二萜合酶如紫杉烯合酶（taxadiene synthase，TXS）的催化下能夠合成紫杉醇的前體紫杉-4（5），11（12）-二烯（taxadiene）；（4）三萜：倍半萜前體FPP在鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）的催化下合成鯊烯（squalene），鯊烯經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SQE）催化加氧轉(zhuǎn)變成2，3-氧化鯊烯（2，3-oxidosqualene），并在不同的鯊烯環(huán)化酶（oxidosqulene cyclase，OSCs）的作用下環(huán)化形成三萜骨架，如β-香樹素（β-amyrin）、羽扇豆醇（Lupeol）、葫蘆二烯醇（Cucurbitadienol）等。因此，不同種類三萜的合成取決于鯊烯環(huán)化酶的種類。萜類骨架在細(xì)胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450，CYP450）、CYP450輔 酶（CYP reductase，CPR）、 脫 氫 酶（dehydrogenases）、 糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase，GT）和酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase，ACT）的作用下會進(jìn)一步進(jìn)行氧化、糖基化和?；然瘜W(xué)修飾，最終獲得不同的萜類化合物，如膜甾醇、油菜素內(nèi)酯、人參皂苷等［11］。1.2.2 萜類的生產(chǎn)方法 近年來，萜類化合物的合成研究成為了生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。大規(guī)模生產(chǎn)高價值的萜類化合物是科研工作者和企業(yè)的共同目標(biāo)。目前萜類的生產(chǎn)方法主要有3種：植物提取法、化學(xué)合成法和生物合成法（表2）。2015年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎得主、中國中醫(yī)科學(xué)院首席科學(xué)家屠呦呦［39］及其同事通過不斷改進(jìn)提取方法，最終于1972年從青蒿中提取到了微量的新型抗瘧藥——青蒿素。但是，萜類在植物中的含量通常很低，且植物提取法還存在野生資源稀缺、分離效果不佳、產(chǎn)量極低的問題。中國科學(xué)院院士涂永強(qiáng)課題組［40］則通過建立仿生合成路線，對具有生物活性萜類抗癌藥物的合成進(jìn)行了大量系統(tǒng)性的化學(xué)合成研究?；瘜W(xué)合成法雖解決了植物提取法中的諸多問題，但仍存在原料昂貴、工藝流程復(fù)雜、立體選擇性低、能耗高、污染大、總收率偏低等問題。相比之下，生物合成法不受原料的限制、生產(chǎn)過程綠色清潔、產(chǎn)物單一、產(chǎn)率提升空間大，具有很大的優(yōu)勢。

表2 萜類生產(chǎn)方法的比較

生物合成法又分為兩種，一種是通過代謝工程手段直接在植物中促進(jìn)萜類的合成；另一種是通過合成生物學(xué)在微生物等底盤細(xì)胞中合成目標(biāo)產(chǎn)物。第一種方法是直接向植物中引入強(qiáng)啟動子驅(qū)動的萜類合酶，從而實(shí)現(xiàn)萜類的生產(chǎn)［41］。如通過過表達(dá)芳樟醇合酶可以大量生產(chǎn)單萜芳樟醇，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植株包括矮牽牛、番茄、康乃馨、馬鈴薯及擬南芥［42-45］。這種代謝工程操作不僅用于高效生產(chǎn)萜類化合物，還可以用于改變作物的一些性狀，如提高觀賞植物和水果等的香味和口感，改善植物的授粉效率，增強(qiáng)植物的抗病和抗蟲能力等。此外，還能幫助理解植物萜類化合物的合成途徑和調(diào)控方式，揭示已有途徑的旁支通路和反饋途徑等。但是，由于植物生長緩慢，且體內(nèi)代謝過程錯綜復(fù)雜，這種萜類合成方法面臨著目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量有限、后期分離困難、生產(chǎn)周期長等問題。為了實(shí)現(xiàn)萜類的高產(chǎn)，研究人員越來越多的開始嘗試合成生物學(xué)手段［46］。

1.3 萜類的合成生物學(xué)研究

1.3.1 萜類合成生物學(xué)的設(shè)計(jì)策略

1.3.1.1 底盤細(xì)胞的選擇及改造 選取不同的底盤細(xì)胞對于萜類的生物合成有關(guān)鍵性的影響。例如，大腸桿菌中萜類前體IPP和DMAPP主要用于tRNA的異戊烯化和FPP的合成，進(jìn)而用于醌類和細(xì)胞壁的合成，因此該底盤細(xì)胞主要用于酮、醇、酸等化學(xué)品而非萜類的生物合成［47］。代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域的先驅(qū)人物，如加州大學(xué)洛杉磯分校的James Liao教授和伯克利分校的Jay Keasling教授，他們的實(shí)驗(yàn)室也曾通過大腸桿菌進(jìn)行萜類化合物的生物合成，但均需重構(gòu)IPP和DMAPP的合成途徑。如Farmer等［48］在大腸桿菌中重構(gòu)MEV途徑，提高了番茄紅素的生物合成產(chǎn)量：向培養(yǎng)基中外源添加丙酮酸，并在重構(gòu)番茄紅素合成途徑的大腸桿菌中過表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸合酶（phosphoenolpyruvate synthase，PPS），使得丙酮酸轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇式丙酮酸，促進(jìn)碳代謝流由丙酮酸向G-3-P逆流，進(jìn)而得到大量類異戊二烯的前體，最終每克細(xì)胞干重中得到了25 mg番茄紅素，比單純重構(gòu)番茄紅素合成途徑的大腸桿菌的發(fā)酵產(chǎn)量提高了5倍。Kim等［49］在重構(gòu)番茄紅素合成途徑的大腸桿菌中，使用CRISPRi技術(shù)重新平衡MEV途徑的代謝流，通過設(shè)計(jì)不同的sgRNA并比較其基因敲除效率，將MVA途徑中的基因表達(dá)平均降低了81.6%，最終使得番茄紅素的產(chǎn)量提高了9倍。Martin［25］則通過在大腸桿菌中建立酵母MEV途徑促進(jìn)FPP的合成，同時過表達(dá)紫穗槐二烯合酶，并向培養(yǎng)基中外源添加甘油（0.8% V/V），最終使得青蒿素前體紫穗槐二烯的積累高達(dá)112.2 mg/L。

由于細(xì)菌缺少翻譯后修飾而難以表達(dá)細(xì)胞色素P450，且很多萜類化合物具有抗菌活性，因此多采用釀酒酵母等真核生物進(jìn)行萜類的生物合成［50，51］。利用酵母細(xì)胞工廠的好處是酵母能夠直接合成較多的DMAPP和IPP，從而為萜類合成提供大量前體物。選用酵母作為底盤細(xì)胞還可以通過酵母基因組的必需基因分析，保留最小基因組，從而在萜類的生物合成過程中減少其內(nèi)源消耗。所有基因工程操作都可以通過染色體融合完成，保證了酵母工程菌株的遺傳穩(wěn)定性。通過酵母全基因組的篩選還能夠獲得一些高活性的內(nèi)源啟動子與終止子，如清華大學(xué)戴俊彪課題組［52］通過篩選釀酒酵母全基因組，獲得了一些酵母來源的啟動子和終止子。此外，他們還在釀酒酵母中構(gòu)建了生物合成的功能模塊，能夠快速實(shí)現(xiàn)多基因代謝通路中的蛋白的異源表達(dá)，并完成多個轉(zhuǎn)錄單元的一步組裝。選擇酵母細(xì)胞的另一個優(yōu)勢是可以通過對酵母細(xì)胞進(jìn)行耐高溫、耐酸、耐鹽等抗逆改造，如清華大學(xué)林章凜教授［53］主持的“973項(xiàng)目”研究了適合微生物的合成生物學(xué)抗逆元器件，獲得了具有重要產(chǎn)業(yè)價值的微生物抗酸器件和工業(yè)菌株，為實(shí)現(xiàn)萜類目的產(chǎn)物的高密度發(fā)酵和產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化奠定了研究基礎(chǔ)。

1.3.1.2 萜類合成途徑的挖掘 合成途徑的挖掘是合成生物學(xué)快速發(fā)展的保障。目前已經(jīng)從擬南芥、水稻、苜蓿、百脈根等不同的植物中分離得到了幾十個編碼鯊烯環(huán)化酶的基因［54］。大量的基因組學(xué)數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞色素P450家族在植物萜類化合物的合成過程中扮演著關(guān)鍵的角色［55］。隨著全基因組測序、第二代DNA測序技術(shù)以及宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的天然產(chǎn)物的代謝途徑被挖掘出來。研究發(fā)現(xiàn)，植物萜類化合物的合成往往伴隨著基因表達(dá)簇結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)。通過萜類化合物基因表達(dá)簇的鑒定，研究人員發(fā)現(xiàn)了不同萜類合成通路中的鯊烯環(huán)化酶、共表達(dá)的CYP450 以及輔酶CPR。如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃三文團(tuán)隊(duì)［56］通過破解黃瓜的基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)黃瓜苦味基因（Bitter，Bi）基因編碼的蛋白為鯊烯環(huán)化酶。為了破解黃瓜苦味合成、調(diào)控及馴化的分子機(jī)制，他們進(jìn)一步挖掘黃瓜組學(xué)數(shù)據(jù)，并結(jié)合代謝組學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)，最終鑒定出9個與黃瓜中葫蘆素C合成相關(guān)的基因（Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G698490、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890、Csa6G088700）［19］。這一系列研究為三萜葫蘆素的生物合成奠定了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

萜類的生物合成是一個多因素調(diào)節(jié)的動態(tài)過程。通過異源基因的密碼子優(yōu)化、啟動子終止子的選取和搭配組合、代謝途徑基因簇的共表達(dá)、合成途徑的標(biāo)準(zhǔn)化組裝、關(guān)鍵調(diào)控基因的精細(xì)調(diào)控、細(xì)胞合成工廠的創(chuàng)建、發(fā)酵條件摸索及發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面的深入研究，能夠顯著提高萜類合成關(guān)鍵酶的異源高效表達(dá)以及萜類的合成能力。

1.3.2 萜類化合物的合成生物學(xué)研究進(jìn)展

1.3.2.1 單萜 釀酒酵母能夠利用體內(nèi)的 MEV途徑合成IPP和DMAPP，進(jìn)而縮合成GPP，為單萜的生物合成提供前體物質(zhì)。因此，在釀酒酵母中外源表達(dá)單萜合酶有望實(shí)現(xiàn)單萜的合成。以芳樟醇為例，Herrero等［57］通過在釀酒酵母T73-4中表達(dá)來源于仙女扇的S-芳樟醇合酶（linalool synthases，LIS）的基因，從而引入了芳樟醇合成代謝通路，構(gòu)建出了能夠有效分泌芳樟醇的重組菌株，最終達(dá)到18 μg/L的積累水平。類似地，Zhang等［58］在釀酒酵母中表達(dá)了來源于軟棗獼猴桃（Actinidiaarguta）的芳樟醇合酶的基因，實(shí)現(xiàn)了芳樟醇的產(chǎn)量為59.85 μg/L。Rico等［59］在表達(dá)芳樟醇合酶的基礎(chǔ)上進(jìn)一步調(diào)節(jié)了該菌株中的類異戊二烯生物合成途徑，通過過表達(dá)羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA還原酶）的催化結(jié)構(gòu)域（truncated HMG-CoA reductase，tHMGR），解除了MEV途徑中羥甲戊酸合成的內(nèi)源限速步驟，最終使得芳樟醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高到132.66 μg/L。考慮到異戊二烯二磷酸異構(gòu)酶（IDI1）參與的異構(gòu)化反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)IPP和DMAPP之間的可逆轉(zhuǎn)化，是實(shí)現(xiàn)GPP合成的重要步驟，江南大學(xué)陳堅(jiān)課題組［60］在過表達(dá)HMG1的催化結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，同時過表達(dá)了IDI1，以期提高釀酒酵母中MEV合成途徑的代謝通量，強(qiáng)化GPP合成供給，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芳樟醇產(chǎn)量仍然只有127.71 μg/L。為了提高單萜在釀酒酵母中的合成，陳堅(jiān)課題組［61，62］進(jìn)行了大量的深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬烯處理釀酒酵母細(xì)胞會誘發(fā)活性氧脅迫，引起菌體凋亡。Parveen等［63］則通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，單萜α單蒎烯（α-terpinene）脅迫會造成釀酒酵母的細(xì)胞膜功能損傷。因此，宿主對單萜的低耐受程度可能是限制單萜產(chǎn)量提高的瓶頸。對于釀酒酵母耐受單萜的機(jī)理研究將為構(gòu)建高單萜耐受性的酵母菌株提供更多的理論依據(jù)。

1.3.2.2 倍半萜 青蒿素是具有內(nèi)過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，是目前研究最多關(guān)注度最高的一種倍半萜。以有效劑量的青蒿素為基礎(chǔ)、輔以傳統(tǒng)抗瘧藥物的聯(lián)合療法（artemisinin-based combination therapy，ACT）被世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)為治療瘧疾的最有效的辦法。由于人工合成青蒿素的難度很大，且價格昂貴，青蒿素的生產(chǎn)曾主要依賴從中國傳統(tǒng)中草藥青蒿中提取，但這種方法產(chǎn)量極低，導(dǎo)致青蒿素類藥物緊缺，價格波動幅度大，ACT療法昂貴，因此亟需尋找更穩(wěn)定的青蒿素生產(chǎn)方法。Keasling團(tuán)隊(duì)［64］對于青蒿素生物合成的研究工作是合成生物學(xué)領(lǐng)域取得的一項(xiàng)突破性進(jìn)展。截止目前，他們已經(jīng)在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了青蒿素前體青蒿酸的合成與產(chǎn)業(yè)化，為化學(xué)合成青蒿素以及活性抗瘧藥物青蒿琥酯（artesunate）提供了大量前體。在該項(xiàng)工作中，他們首先在酵母中過表達(dá)了來自青蒿的紫穗槐-4，11-二烯合酶，實(shí)現(xiàn)了FPP向青蒿素前體紫穗槐二烯的合成，但合成量很低，這是因?yàn)榻湍讣?xì)胞中的大部分IPP和DMAPP前體會進(jìn)入麥角固醇合成通路。隨后，他們在該菌株中重構(gòu)了MEV途徑，使得與FPP合成相關(guān)的基因發(fā)生上調(diào)，而FPP流向其他通路如固醇的基因表達(dá)則發(fā)生下調(diào)，從而提高了FPP的合成產(chǎn)量，并通過染色體重組將MEV途徑整合到酵母基因組上，保證了改造菌株的遺傳穩(wěn)定性，再輔助以固醇轉(zhuǎn)錄因子UPC2的表達(dá)，最終使得紫穗槐二烯的合成產(chǎn)量提高到153 mg/L，比之前的報(bào)道高出了500倍。后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)甚至使得紫穗槐二烯的產(chǎn)量達(dá)到27 g/L。由于很多萜類代謝的中間產(chǎn)物如FPP對細(xì)胞均有毒性，研究者希望通過在大腸桿菌中構(gòu)建壓力傳感器，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝負(fù)荷，進(jìn)而提高目的產(chǎn)物的表達(dá)。Keasling實(shí)驗(yàn)室的成員通過全基因組的轉(zhuǎn)錄芯片測序，鑒定出了一些能夠響應(yīng)有毒代謝產(chǎn)物的啟動子。采用響應(yīng)FPP積累的啟動子驅(qū)動大腸桿菌中紫穗槐二烯合成途徑的基因表達(dá)，結(jié)果使得紫穗槐二烯的產(chǎn)量達(dá)到1.6 g/L。因此，根據(jù)目的產(chǎn)物的合成途徑，選取對某個中間產(chǎn)物敏感的啟動子驅(qū)動目的產(chǎn)物的基因表達(dá)，可以有效提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)出。這一方法將是提高目的產(chǎn)物的一種重要的通用工具［65］。為了實(shí)現(xiàn)紫穗槐二烯向青蒿酸的轉(zhuǎn)變，他們從青蒿中分離得到了一種CYP450單加氧酶CYP71AV1，并協(xié)同表達(dá)CYP71AV1的輔酶CPR，實(shí)現(xiàn)了紫穗槐二烯的三步氧化，最終使得1 L發(fā)酵罐中青蒿酸產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到115 mg/L，生產(chǎn)效率比植物提取法提高了兩個數(shù)量級。為了進(jìn)一步提高青蒿酸的合成，Keasling團(tuán)隊(duì)在酵母中將MEV途徑中的所有的酶全部進(jìn)行了過表達(dá)，青蒿酸的產(chǎn)量達(dá)到約1.6 g/L，而紫穗槐二烯的產(chǎn)量更是比青蒿酸高10倍以上。于是，他們進(jìn)一步對紫穗槐二烯生產(chǎn)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終使得紫穗槐二烯的產(chǎn)量高達(dá)＞40 g/L，為青蒿素的化學(xué)合成提供了大量前體［66］。在此基礎(chǔ)上，他們團(tuán)隊(duì)在青蒿中鑒定出了兩個新的植物脫氫酶（artemisnic alcohol dehydrogenase，ADH1；artemisnic aldehyde dehydrogenase，ALDH1）和一個細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome b5，CYB5），通過在酵母中進(jìn)行表達(dá)，讓紫穗槐二烯到青蒿酸的合成過程變得更具體高效，最終使得青蒿酸的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了25 g/L［67］。這項(xiàng)技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)已經(jīng)免費(fèi)釋放。Keasling團(tuán)隊(duì)的這一系列工作極大地推動了青蒿琥酯等高效抗瘧藥物成分的生產(chǎn)，有效地降低了ACT治療的價格，是合成生物學(xué)領(lǐng)域的經(jīng)典案例，也對其他昂貴藥物的合成生物學(xué)研究具有寶貴的借鑒意義［68］。

1.3.2.3 二萜 很多萜類是傳統(tǒng)中藥的關(guān)鍵藥用成分，如丹參酮類化合物（tanshinones）屬于松香烷型去甲二萜化合物，是中藥丹參的主要脂溶性活性成分，通常由其前體次丹參酮二烯（Miltiradiene）和鐵銹醇合成得到。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中藥研究所黃璐琦課題組［69，70］通過功能基因組學(xué)技術(shù)從丹參中鑒定了兩個次丹參酮二烯合酶：SmCPS（labdadienyl/ copalyl diphosphate synthase）和SmKSL（kaurene synthase-like）。天津工業(yè)生物技術(shù)研究所張學(xué)禮課題組［71］將SmCPS和SmKSL整合到酵母基因組上，然后一方面過表達(dá)tHMGR抑制酵母中FPP向麥角固醇的合成；另一方面則過表達(dá)ERG20-BTS1-SaGGPS和一個固醇調(diào)節(jié)因子UPC2.1，使得次丹參酮二烯的合成達(dá)到了61.8 mg/L，分批發(fā)酵的方式能將次丹參酮二烯的合成進(jìn)一步提高到488 mg/L。中國科學(xué)院大連物理研究所趙宗保課題組［72］。在采用合成生物學(xué)生產(chǎn)次丹參酮二烯的過程中，提出了一種新的模塊途徑工程（modular pathway engineering，MOPE）策略，通過將次丹參酮二烯合成途徑的4個關(guān)鍵酶進(jìn)行融合表達(dá)，包括催化FPP合成的ERG20（farnesyl diphosphate synthase）、將FPP轉(zhuǎn)化成GGPP的BTS1（GGPP synthase）以及兩個次丹參酮二烯合酶SmCPS和SmKSL的融合，使得次丹參酮二烯的合成代謝流更加高效，最終構(gòu)建出了高產(chǎn)次丹參酮二烯的酵母工程菌株，產(chǎn)量高達(dá)365 mg/L。隨后，他們利用第二代DNA測序技術(shù)鑒定了6個與丹參酮積累相關(guān)的CYP450基因，并通過基因表達(dá)和體外酶活篩選發(fā)現(xiàn)，CYP76AH1負(fù)責(zé)催化次丹參酮二烯轉(zhuǎn)化生成鐵銹醇。通過從中藥丹參中克隆不同的CPR，進(jìn)行CYP450和CPR等模塊元件間的適配性分析，鑒定出SmCPR1（Salvia miltiorrhizaCPR）為更合適的CYP76AH1輔酶，最終使得搖瓶培養(yǎng)條件下酵母細(xì)胞合成鐵銹醇的產(chǎn)量達(dá)到10.5 mg/L［73］。隨著深度測序、代謝組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對丹參的基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)的挖掘，越來越多的與丹參酮合成通路相關(guān)的基因被鑒定出來，這些數(shù)據(jù)為丹參酮的合成生物學(xué)研究奠定了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)［74-77］。丹參酮合成生物學(xué)的研究對于其他藥用、食用萜類的異源合成將具有重要的參考價值［78］。

1.3.2.4 三萜 三萜人參皂苷是人參中的主要有效成分，屬于糖苷類化合物，包括齊墩果烷型無環(huán)三萜類皂苷和達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷，后者又包含人參二醇型皂苷和人參三醇型皂苷。人參皂苷在人參和西洋參中的含量很低，大大限制了它的臨床應(yīng)用。因此，通過合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)人參皂苷已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。人參皂苷生物合成包含20余步酶促反應(yīng)。目前，已經(jīng)從人參屬植物中克隆出20多種與人參皂苷合成相關(guān)的基因，并進(jìn)行了相應(yīng)的功能驗(yàn)證：鑒定出兩種鯊烯環(huán)化酶——達(dá)瑪烯二醇-II合酶（darmmarenediol，DS）和β-香樹素合酶（β-amyrin synthase，AS），它們分別參與了2，3-氧化鯊烯向達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型人參皂苷的合成過程［79，80］；發(fā)現(xiàn)一種細(xì)胞色素酶CYP716A47參與了達(dá)瑪烯二醇-II向原人參二醇（protopanaxadiol）的轉(zhuǎn)變［81］。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院周志華課題組［21］首次鑒定了一個來源于人參的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTPg1），通過在酵母中與CYP716A47及其輔酶ATR2-1同時過表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了人參二醇型皂苷CK的從頭合成。周志華課題組與趙宗保團(tuán)隊(duì)的萜類生物合成研究均屬于以中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院趙國屏為首席的“新功能人造生物器件的構(gòu)建及集成”973項(xiàng)目，該項(xiàng)目在萜類的異源合成上已經(jīng)取得了多項(xiàng)重要進(jìn)展。此外，北京理工大學(xué)李春課題組在釀酒酵母中將來源于光果甘草的β-香樹素合酶，以及 IDI1、ERG20、ERG9、ERG1等促進(jìn)2，3-氧化鯊烯合成的酶的基因同時進(jìn)行過表達(dá)，并將表達(dá)質(zhì)粒同源重組到染色體中提高基因表達(dá)的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了齊墩果烷型人參皂苷前體β-香樹素的合成。除此之外，該項(xiàng)研究還有兩點(diǎn)重要發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)質(zhì)粒的啟動子上構(gòu)建固醇調(diào)控元件SRE（-TCGTATA-）是一種有效的上調(diào)固醇類蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式；在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，以乙醇作為補(bǔ)料與以葡萄糖作為補(bǔ)料相比，可以顯著提高β-香樹素的合成產(chǎn)量，最終達(dá)到138.8 mg/L［82］。

2 展望

萜類化合物的生物功能和藥物活性使其在食品、日化、醫(yī)療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，因此，萜類化合物的高效合成具有廣闊的市場前景。通過對萜類的生物合成途徑的鑒定研究，設(shè)計(jì)開發(fā)出一套組合調(diào)控萜類合成途徑的功能模塊，并在底盤細(xì)胞中創(chuàng)建合成工廠，可以實(shí)現(xiàn)萜類的體外合成。因此，合成生物學(xué)的發(fā)展為實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)食用、藥用萜類提供了有力的支撐。

為提高萜類化合物的生物合成效率，實(shí)際操作過程中應(yīng)考慮以下幾個關(guān)鍵因素：萜類前體的含量、引入的萜類合酶的亞細(xì)胞定位、萜類合酶的活性、萜類合成通路的旁支通路，以及萜類化合物的生物毒性。此外，在“模塊途徑工程策略”快速組裝代謝途徑的基礎(chǔ)上，還可以通過優(yōu)化前體供給、細(xì)胞色素還原酶匹配、宿主選擇、發(fā)酵優(yōu)化等操作，構(gòu)建高產(chǎn)酵母工程菌株，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效生產(chǎn)。任何一項(xiàng)學(xué)科的迅猛發(fā)展都不是孤立封閉的，因此，為快速推進(jìn)合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，未來應(yīng)加強(qiáng)以下幾個學(xué)科和技術(shù)的應(yīng)用：（1）結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多種功能組學(xué)方法，對現(xiàn)有的生物系統(tǒng)和代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行更加全面的了解；（2）通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)對合成途徑的關(guān)鍵元件進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，了解具體催化機(jī)制；（3）通過定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)等蛋白質(zhì)工程對關(guān)鍵酶進(jìn)行改造，包括提高關(guān)鍵酶的活性、增加酶的新功能等；（4）從生物反應(yīng)動力學(xué)角度出發(fā)，對合成途徑的元件模塊進(jìn)行復(fù)合體組裝以提高生物反應(yīng)速率；（5）采用計(jì)算生物學(xué)技術(shù)輔助分析整個代謝系統(tǒng)，通過調(diào)整代謝流、抑制旁支通路、解除反饋抑制等手段提高目的產(chǎn)物的生產(chǎn)；（6）利用最新的先進(jìn)技術(shù)如CRISPRi等對底盤細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)源基因的有效敲除及最小基因組的快速構(gòu)建；（7）借鑒發(fā)酵工程多尺度（基因、細(xì)胞、反應(yīng)器）調(diào)控策略，在后期發(fā)酵過程考慮細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成之間的平衡，從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)過程的優(yōu)化放大；（8）借助Amyris等大型合成生物學(xué)公司輔助搭建更為成熟、自動化的合成生物學(xué)平臺，加速該領(lǐng)域的工業(yè)化應(yīng)用和產(chǎn)品的開發(fā)［83］。綜上所述，采用合成生物學(xué)策略合成萜類化合物，有望成為植物源萜類生產(chǎn)的有效技術(shù)手段。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Research Progresses in the Synthetic Biology of Terpenoids

SUN Li-chao LI Shu-ying WANG Feng-zhong XIN Feng-jiao
（Institute of Food Science and Technology CAAS，Beijing 100193）

The terpenoids represent the largest class of natural products with biological activities of antitumor and anti-allergy，thus they have been widely applied in the area of food，cosmetics and medical health，presenting huge potential and broad market prospects. Recent years，researchers applied functional genomics and metabonomics approaches to deeply study the biosynthesis pathways of terpenoids，providing tons of data for their synthetic biology. The construction of engineered yeasts using synthetic biology enabled the efficient synthesis of multi-target terpenoids，and highly improved the overall production level. Thus，the synthetic biology approach is expected to be an efficient way of producing plant-derived terpenoids. First，we introduced the concept of synthetic biology，summarized the important functions and applications of plant-derived terpenoids，briefly reviewed the biosynthesis pathways，and concluded the alternative production ways. Then，we discussed the design strategies of synthetic biology for terpenoids thoroughly. Finally，we elaborated the advances on the biosynthetic biology of varied terpenes with common terpenes as the studied cases.

terpenoids；biosynthesis；terpene synthesis and design；progresses on synthetic biology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.007

2016-08-29

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571963）

孫麗超，女，助理研究員，研究方向：生物酶研究與應(yīng)用；E-mail：sun2004go@163.com

王鳳忠，男，研究員，研究方向：功能食品與生物活性物質(zhì)；E-mail：wangfengzhong@sina.com辛鳳姣，女，研究員，研究方向：生物酶研究與應(yīng)用；E-mail：xinfengjiao@caas.cn