基于液滴微流控技術(shù)的超高通量篩選體系及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

馬富強(qiáng)楊廣宇，2（. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2. 華東理工大學(xué)上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

基于液滴微流控技術(shù)的超高通量篩選體系及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

馬富強(qiáng)1楊廣宇1，2
（1. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2. 華東理工大學(xué)上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

構(gòu)建高效的合成生物學(xué)體系經(jīng)常需要進(jìn)行大量的篩選工作來優(yōu)化人工體系的運(yùn)行效率。液滴微流控（droplet microfluidics）技術(shù)將常規(guī)篩選體系微型化，在只有皮升（pL）級(jí)體積、大小均一的反應(yīng)器中對(duì)酶反應(yīng)或目標(biāo)代謝產(chǎn)物進(jìn)行單細(xì)胞水平的檢測和篩選，篩選速度可高達(dá)108克隆/d，從而極大地提升了人們對(duì)催化元件乃至工程菌株優(yōu)化的能力。綜述了液滴微流控技術(shù)在合成生物學(xué)應(yīng)用中的技術(shù)背景，重點(diǎn)闡述了目標(biāo)酶反應(yīng)及產(chǎn)物檢測的熒光信號(hào)偶聯(lián)策略，進(jìn)一步介紹了液滴微流控技術(shù)在酶催化元件以及代謝通路的篩選改造方面的研究進(jìn)展，并展望了該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。

液滴微流控；合成生物學(xué)；代謝途徑；酶；高通量篩選

隨著現(xiàn)代生物學(xué)DNA合成技術(shù)的飛速進(jìn)步，大規(guī)模合成復(fù)雜代謝通路乃至微生物基因組成為現(xiàn)實(shí)，進(jìn)而有力地推動(dòng)了合成生物學(xué)的發(fā)展［1，2］。利用人工設(shè)計(jì)構(gòu)建的微生物作為細(xì)胞工廠進(jìn)行化學(xué)品的綠色高效生產(chǎn)，有望為解決人類發(fā)展面臨的資源、能源、健康、環(huán)境等若干重大問題提供解決方案。正因?yàn)槿绱?，合成生物學(xué)在世界范圍內(nèi)得到了越來越廣泛的關(guān)注，并成為生物技術(shù)的前沿學(xué)科。自從2006年加州大學(xué)伯克利分校Keasling教授研究組利用人工代謝途徑在酵母體內(nèi)合成青蒿酸以來［3］，合成生物學(xué)已經(jīng)在藥物分子、生物能源、功能材料、保健食品等多種重要產(chǎn)品的合成方面取得重要進(jìn)展。截至到2015年，全世界至少已有81家公司或研究機(jī)構(gòu)的116種合成生物學(xué)產(chǎn)品得到開發(fā)應(yīng)用，總產(chǎn)值高達(dá)52億美元［4］，預(yù)期2025年這一產(chǎn)值將增長到1 000億美元［5］。

然而，由于人們對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還非常有限，使得構(gòu)建人工生物系統(tǒng)面臨著巨大的困難：對(duì)生物元件的性能表征和機(jī)制解析不足，導(dǎo)致由多種蛋白質(zhì)分子形成的裝置和作用網(wǎng)絡(luò)行為難以預(yù)測，而當(dāng)這些裝置和網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞中發(fā)揮功能時(shí)，其行為又會(huì)受到細(xì)胞內(nèi)多種環(huán)境因素的影響，使得人工生物體系往往無法按照預(yù)先的行為進(jìn)行工作，嚴(yán)重限制了合成生物學(xué)愿景的實(shí)現(xiàn)。為解決這一問題，科學(xué)家們嘗試通過定向進(jìn)化技術(shù)來創(chuàng)造符合預(yù)期功能的微生物菌株。相比于常規(guī)的理性設(shè)計(jì)方法，定向進(jìn)化不依賴于對(duì)生物系統(tǒng)的深入認(rèn)識(shí)，而是模擬自然界達(dá)爾文進(jìn)化原理，首先在實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建大容量隨機(jī)突變庫，然后在施加人工選擇壓力的條件下，從庫中篩選出極少數(shù)符合預(yù)期表型的個(gè)體，已經(jīng)在多種酶基因、代謝途徑、乃至微生物的改造中取得了成功［6-9］，但定向進(jìn)化成功的關(guān)鍵在于篩選方法的效率和準(zhǔn)確性。常規(guī)篩選方法（如搖瓶篩選、孔板篩選等）存在通量較低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，獲得一株具有商業(yè)價(jià)值的生產(chǎn)菌株往往需要花費(fèi)巨額資金成本，同時(shí)消耗大量不同領(lǐng)域技術(shù)人員的勞動(dòng)力［9］，隨著人們對(duì)化學(xué)品綠色制造效率的要求越來越高、種類越來越復(fù)雜，這種高投入、高成本、低效的開發(fā)策略越來越難以滿足需求。

微流控芯片（microfluidic chip）技術(shù)，又稱為芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip）或微全分析系統(tǒng)（miniaturized total analysis systems），是指通過微加工技術(shù)將常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成在只有幾平方厘米尺寸的芯片中，從而實(shí)現(xiàn)微型化、自動(dòng)化和集成化的技術(shù)體系。美國《Business2.0》雜志將微流控技術(shù)列為“改變世界”的七大技術(shù)之一，《Nature》雜志也稱這一技術(shù)可能成為“這一世紀(jì)的技術(shù)”［10］。微流控芯片技術(shù)的發(fā)展所催生的液滴微流控（droplet microfluidics）篩選技術(shù)以其超高通量、高靈敏度、定量準(zhǔn)確的功能，為合成生物學(xué)中催化元件、代謝途徑乃至菌株的篩選問題的解決提供了良好的解決方案。本文綜述了液滴微流控篩選技術(shù)在合成生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的主要進(jìn)展，重點(diǎn)關(guān)注了微反應(yīng)器中目的產(chǎn)物分子與熒光信號(hào)偶聯(lián)的策略這一核心問題，并介紹了近年來液滴微流控篩選技術(shù)在催化元件（酶）和代謝途徑的優(yōu)化改造方面的應(yīng)用實(shí)例，對(duì)未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 液滴微流控體系篩選技術(shù)原理

液滴微流控技術(shù)是微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展方向，其原理是通過特殊的微通道設(shè)計(jì)，對(duì)微米級(jí)尺度的微液滴（粒度CV值低于3%）進(jìn)行大量制備、混勻、融合、分割、孵育、檢測、分選等操作（圖1），從而完成一系列復(fù)雜的樣品處理過程［11］。由于微液滴良好的生物相容性，可以作為微反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增、恒化培養(yǎng)、細(xì)胞裂解、DNA擴(kuò)增、體外蛋白質(zhì)表達(dá)、酶反應(yīng)等操作，為合成生物學(xué)定向進(jìn)化的篩選通量問題的解決提供了契機(jī)。在一個(gè)典型的液滴微流控的篩選體系中，科學(xué)家能利用皮升級(jí)（pL）體積的微液滴作為反應(yīng)器，將酶基因、人工構(gòu)建的代謝途徑、基因表達(dá)產(chǎn)物等包裹在其中，利用特定的熒光探針對(duì)其進(jìn)行顯色（圖2），再借助于商品化的流式細(xì)胞儀或微流控檢測/分選芯片，對(duì)這些微液滴進(jìn)行高效的分析與分選［12-14］。由于這種技術(shù)體系可以在極高的速度下工作，其篩選通量高達(dá)108/d，顯著地提高了人們對(duì)生物體系進(jìn)行高通量篩選的能力，為設(shè)計(jì)高效的酶、代謝途徑乃至微生物菌株提供了有力的工具。

與常規(guī)分析體系相比，基于液滴微流控的高通量篩選體系具有兩個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢：（1）極大提升了人們對(duì)于大規(guī)模樣品的分析能力，微流控體系處理微液滴的速度可高達(dá)108/d，在合成生物學(xué)家進(jìn)行催化元件、代謝途徑乃至菌株的高通量篩選時(shí)，可以極大地提升效率；（2）由于每個(gè)微液滴的體積只有皮升級(jí)，相比于常規(guī)的微升至毫升級(jí)反應(yīng)體系縮小了百萬倍以上，對(duì)試劑的需求量大大降低，在一些昂貴樣品的分析中具有更加明顯的優(yōu)勢。

2 微液滴篩選的熒光偶聯(lián)策略

現(xiàn)有的液滴微流控篩選體系主要使用熒光信號(hào)來對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量，這主要是由于熒光檢測具有很高的靈敏度，非常適合作為皮升級(jí)微反應(yīng)器的檢測信號(hào)。因此利用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行高通量篩選，首先需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問題是將需要分析的生物活性轉(zhuǎn)換為可檢測的熒光信號(hào)，這是開發(fā)液滴微流控篩選系統(tǒng)所面臨的核心問題。目前常用的熒光信號(hào)進(jìn)行偶聯(lián)的策略主要有以下幾種（圖3）。

圖1 微流控液滴操縱技術(shù)

圖2 基于液滴微流控的超高通量篩選體系原理圖

2.1 用于酶活性檢測的熒光底物

熒光底物是探測酶活性的靈敏手段，其本身無熒光或只有很低的熒光信號(hào)，而其酶促反應(yīng)產(chǎn)物則具有很強(qiáng)的熒光信號(hào)，可以根據(jù)反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度的變化對(duì)酶活性進(jìn)行定量分析（圖3-A）。目前已經(jīng)有多種商品化熒光底物可用于酶活性檢測，包括糖苷酶［15，16］、酯酶/脂肪酶［17］、蛋白酶［18］、過氧化物酶［19］、巰基內(nèi)酯酶［20］等。除此之外，也有人利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（FRET）設(shè)計(jì)了熒光探針，利用酶反應(yīng)前后底物熒光波長的強(qiáng)烈變化來探測酶活性，已經(jīng)在蛋白酶［21-23］、酯酶/脂肪酶［24］、β-內(nèi)酰胺酶［25］、神經(jīng)節(jié)苷脂降解酶［26］等酶活性中得到了應(yīng)用。

目前絕大多數(shù)熒光底物都是為宏觀體系下比色皿中或96孔板中的酶活性檢測所開發(fā)的，大都是基于熒光素、香豆素、試鹵靈等疏水性較強(qiáng)熒光基團(tuán)的衍生物。然而，在用于微液滴體系中的時(shí)候，由于微液滴的油水相界面并不是嚴(yán)格的物理隔離，這些疏水的熒光基團(tuán)在微液滴中保留性較差，會(huì)快速擴(kuò)散到油相中［27，28］或通過臨界膠束傳遞的方式在臨近微液滴之間快速擴(kuò)散［29，30］，造成不同反應(yīng)體系的交叉干擾，影響酶活性檢測的準(zhǔn)確性。為解決這一問題，研究者們通過引入極性較強(qiáng)的磺酸基或羧基修飾，大大提高了熒光信號(hào)在微液滴中的穩(wěn)定性，使香豆素在微液滴中泄漏的半衰期從2.1 s提高到2.8 d以上。目前這種策略已經(jīng)成功用于氧化酶［31］、內(nèi)酰胺酶［32］及葡萄糖苷酶［33］的熒光底物設(shè)計(jì)。近期，本課題組又進(jìn)一步提出了液滴熒光捕獲（Fluorescence droplet entrapment，F(xiàn)DE）的底物設(shè)計(jì)策略，提出自身具有較高疏水性、但在酶反應(yīng)后會(huì)釋放高親水性熒光基團(tuán)的底物可能更加適合微液滴體系的酶活性檢測［34］。具有FDE效應(yīng)的底物可以通過油相擴(kuò)散到微液滴中進(jìn)行酶反應(yīng)，而產(chǎn)生的強(qiáng)親水性熒光產(chǎn)物具有較好的液滴保留穩(wěn)定性，因此能夠同時(shí)增加酶反應(yīng)可控性并降低熒光背景，從而實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的酶活性定量。基于FDE熒光底物設(shè)計(jì)策略，我們已經(jīng)提出了包括糖苷酶、蛋白酶、酯酶、脂肪酶等重要酶活性檢測的熒光底物結(jié)構(gòu)，有望為一系列重要酶活性的液滴微流控高效篩選方法建立鋪平道路［34］。

圖3 液滴微流控體系的熒光信號(hào)偶聯(lián)策略

2.2 酶聯(lián)熒光探針偶聯(lián)代謝產(chǎn)物檢測

許多重要的小分子代謝產(chǎn)物都無法直接通過熒光進(jìn)行檢測，成為利用液滴微流控體系進(jìn)行代謝途徑和微生物菌株篩選的瓶頸。利用多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以間接將這些小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)，為解決這一問題提供有效途徑。典型的策略是通過特異性識(shí)別目標(biāo)代謝產(chǎn)物的氧化還原酶，可以催化目標(biāo)化合物的氧化反應(yīng)生成過氧化氫或NADH，再利用相應(yīng)的偶聯(lián)酶及熒光探針將過氧化氫或NADH轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的熒光偶聯(lián)（圖3-B）。例如，Hammar等［35］采用乳酸脫氫酶將乳酸氧化為丙酮酸，同時(shí)將NAD+還原為NADH，再利用商品化的NADH熒光顯色試劑盒（Cayman Chemical公司生產(chǎn)）將NADH轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)（圖3-E），并用于從乳酸產(chǎn)生軍的紫外誘變庫中篩選高產(chǎn)菌株；Wang等［36］采用乳酸氧化酶將乳酸氧化生成過氧化氫，再利用過氧化物酶（如辣根過氧化物酶）和過氧化氫相應(yīng)的熒光探針（如Invitrogen公司的Amplex UltraRed 探針）將過氧化氫轉(zhuǎn)化為紅色熒光物質(zhì)試鹵靈（resorufin）（圖3-D），作者利用該顯色方法能夠?qū)O少量的產(chǎn)乳酸細(xì)胞從大量背景細(xì)胞中有效富集；類似地，Abalde-Cela等［37］采用乙醇氧化酶將乙醇氧化生成過氧化氫，再進(jìn)一步將過氧化氫轉(zhuǎn)化為試鹵靈，利用該體系也能夠?qū)a(chǎn)乙醇菌株從大量背景細(xì)胞中有效富集。目前，多酶偶聯(lián)策略已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微反應(yīng)器中的乳酸［35，36］、乙醇［37］、木糖［36］、葡萄糖［38，39］等多種產(chǎn)物進(jìn)行定量。隨著更多專一性氧化酶的開發(fā)和利用，這一體系有潛力擴(kuò)展至各種糖類、氨基酸、脂類及激素類代謝產(chǎn)物的定量，從而為多種重要代謝途徑和菌株定向進(jìn)化提供有效的篩選方法。

2.3 生物傳感器代謝產(chǎn)物檢測

利用微生物自身的遺傳調(diào)控機(jī)制來感應(yīng)代謝產(chǎn)物的技術(shù)，稱為生物傳感器（biosensors）［9］。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（transcriptional regulator，TR）是應(yīng)用十分廣泛的生物傳感器，由一系列調(diào)控DNA序列及其編碼的調(diào)控蛋白組成，DNA序列本身或其編碼的蛋白質(zhì)能夠響應(yīng)特定的代謝產(chǎn)物，當(dāng)沒有代謝產(chǎn)物存在時(shí)，由于調(diào)控序列本身的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)或調(diào)控蛋白與DNA結(jié)合而阻遏了下游基因的表達(dá)；有代謝產(chǎn)物存在時(shí)，代謝產(chǎn)物與調(diào)控序列或調(diào)控蛋白結(jié)合，破壞原有的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)或調(diào)控蛋白構(gòu)象，進(jìn)而解除對(duì)其下游基因表達(dá)的阻遏。例如，常見的乳糖操縱子，由該操縱子編碼的阻遏蛋白能夠與啟動(dòng)子序列結(jié)合，阻遏下游蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，當(dāng)阻遏蛋白與乳糖結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變，釋放出啟動(dòng)子序列，最終啟動(dòng)下游蛋白的表達(dá)［40］。微生物體內(nèi)存在各種不同類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，因而能夠?yàn)椴煌x分子的熒光檢測提供豐富的工具［41-43］。另一種生物傳感器是基于mRNA水平調(diào)控的核糖體開關(guān)（riboswitch），核糖體開關(guān)是位于RNA 5'末端的非翻譯區(qū)序列，能夠形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，阻礙其下游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome-binding site，rbs）與核糖體的結(jié)合，進(jìn)而阻礙下游基因的翻譯；當(dāng)核糖體開關(guān)與特定的代謝分子結(jié)合后，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，釋放出核糖體結(jié)合位點(diǎn)，最終解除對(duì)下游基因翻譯的抑制［44，45］。將熒光蛋白基因置于生物傳感器調(diào)控序列的下游，可以通過熒光蛋白的表達(dá)量來反映出代謝產(chǎn)物的濃度，從而能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物與熒光信號(hào)的偶聯(lián)（圖3-C），結(jié)合流式細(xì)胞儀的FACS功能，可以分選出熒光信號(hào)強(qiáng)、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量高的菌株，該策略能夠在催化元件性能提升［46，47］以及高產(chǎn)菌株鑒定［48，49］中發(fā)揮重要作用。例如，Cheng等［46］利用精氨酸響應(yīng)的生物傳感器，提高了精氨酸脫亞胺酶的活性及對(duì)底物的親和力，突變體能夠催化在生理環(huán)境下濃度極低的精氨酸，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長具有顯著的抑制作用；Siedler等［47］利用能夠響應(yīng)NADPH的SoxR傳感器，建立了NADPH依賴型酶的篩選體系，并運(yùn)用該體系提高NADPH依賴型乙醇脫氫酶的催化活性；Binder等［49］采用來源于Corynebacterium glutamicum的傳感器LysG來檢測賴氨酸的濃度，通過FACS篩選從宿主全基因組突變庫中獲得了L-賴氨酸的高產(chǎn)菌株并進(jìn)一步鑒定出了相關(guān)的突變基因型。最近，清華大學(xué)張翀、邢新會(huì)教授課題組開發(fā)了中間產(chǎn)物傳感器輔助的推-拉策略（intermediate sensorassisted push-pull strategy），作者采用L-色氨酸生物傳感器來探測脫氧紫色桿菌素（deoxyviolacein）生物合成途徑的重要中間體——L-色氨酸，利用該體系分別對(duì)中間體前后兩個(gè)合成模塊進(jìn)行優(yōu)化，首先通過篩選提高L-色氨酸的產(chǎn)量，然后篩選L-色氨酸高轉(zhuǎn)化率的菌株，最終成功將脫氧紫色桿菌素的產(chǎn)量提高了4.4倍［50］。

2.4 其他熒光偶聯(lián)策略

除上述列舉的熒光偶聯(lián)策略，人們還針對(duì)一些特殊的應(yīng)用開發(fā)了更加多樣化的熒光偶聯(lián)策略。Pitzler等［51］針對(duì)肌醇六磷酸酶（phytase）的活性設(shè)計(jì)了基于熒光凝膠的毛-核（fur-shell）熒光偶聯(lián)方法。該方法利用酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基引發(fā)poly（ethyleneglycol）-acrylate的聚合反應(yīng)（Fenton’s reaction），同時(shí)將熒光分子嵌合在聚合物中，從而以宿主細(xì)胞為核心，形成一層熒光凝膠的“毛”供檢測。Larsen等［52］開發(fā)了DNA聚合酶的通用性酶活性熒光偶聯(lián)策略：他們通過將單鏈DNA模板的5'末端共價(jià)連接熒光基團(tuán)，再合成與5'端互補(bǔ)的寡核苷酸并連接上熒光淬滅基團(tuán)，形成淬滅子（DNA-quencher）。在DNA復(fù)制之前，熒光基團(tuán)處于淬滅狀態(tài)，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，淬滅子與模板的結(jié)合被新合成的DNA片段取代，釋放出熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度反映了目標(biāo)酶的催化效率。此外，F(xiàn)ischlechner等［53］開發(fā)了凝膠殼微球（gel-shell beads）的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)常規(guī)微液滴的熒光信號(hào)偶聯(lián)功能；Woronoff等［54］開發(fā)了活性調(diào)節(jié)翻譯（activity-fed translation，AFT）的酶活性熒光偶聯(lián)策略，酶催化產(chǎn)生的產(chǎn)物能夠啟動(dòng)微反應(yīng)器中無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯（in vitro transcription and translation，IVTT）體系，進(jìn)而合成反映酶活性高低的熒光蛋白。新的熒光偶聯(lián)策略的開發(fā)，將不斷擴(kuò)展液滴微流控技術(shù)在合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

3 液滴微流控技術(shù)在催化元件篩選中的應(yīng)用

由各類酶分子構(gòu)成催化網(wǎng)絡(luò)為細(xì)胞提供生理活動(dòng)所需的能量、合成或降解其他生物分子、傳遞和處理各種信號(hào)等，是構(gòu)成復(fù)雜生命過程的基礎(chǔ)［55］。利用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行高通量篩選，可以助力定向進(jìn)化或宏基因組技術(shù)獲得符合預(yù)期性質(zhì)的新酶資源，為合成生物學(xué)提供優(yōu)良的催化元件。

2010年，Agresti等［19］率先利用液滴微流控體系對(duì)辣根過氧化物酶進(jìn)行了定向進(jìn)化，通過對(duì)107個(gè)展示在酵母細(xì)胞表面的突變體進(jìn)行篩選，成功將初始催化效率已經(jīng)很高的商品化酶活性又提高了10倍。整個(gè)進(jìn)化歷程篩選時(shí)間累計(jì)只有10 h，比常規(guī)的孔板法提高1 000倍；消耗試劑總體積150 μL，比孔板法降低100萬倍以上，充分顯示出液滴微流控體系作為新一代超高通量篩選體系的巨大優(yōu)勢。之后，來自不同研究組的科研人員進(jìn)一步對(duì)液滴微流控超高通量篩選系統(tǒng)進(jìn)行了一系列的技術(shù)改進(jìn)和體系優(yōu)化，Kintses等［56］開發(fā)了微反應(yīng)器中的細(xì)胞破碎技術(shù)，將單細(xì)胞和細(xì)胞裂解試劑同時(shí)包裹進(jìn)微反應(yīng)器，從而使該系統(tǒng)可以用于胞內(nèi)酶的檢測篩選；Hosokawa等［57］和Colin等［58］分別將該系統(tǒng)擴(kuò)展到從宏基因組中發(fā)掘新酶資源，鑒定出了一系列新酶基因；本課題組與美國密歇根大學(xué)Katsuo Kurabayashi教授課題組合作，建立了雙色熒光液滴微流控篩選體系，可以同時(shí)檢測酶對(duì)兩種熒光底物的催化活性，進(jìn)而可以對(duì)酶的立體選擇性、區(qū)位選擇性、底物特異性等復(fù)雜性質(zhì)進(jìn)行改造。應(yīng)用該體系，我們成功將嗜熱酯酶對(duì)S型異丙基布洛芬底物的立體選擇性提高了700倍（Ma，Yang等，未發(fā)表）。

目前，利用液滴微流控體系已成功對(duì)各類酶的不同性質(zhì)進(jìn)行了改造。表1總結(jié)了利用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行酶性質(zhì)改造或從宏基因組中發(fā)掘新酶資源的實(shí)例（截至2016年9月）。

表1 液滴微流控技術(shù)酶性質(zhì)改造及新酶發(fā)現(xiàn)實(shí)例

4 液滴微流控技術(shù)在代謝產(chǎn)物檢測與篩選中的應(yīng)用

液滴微流控技術(shù)還可以對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的特定代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析與篩選（圖3-B），因此在人工代謝途徑和微生物菌株的定向進(jìn)化中都具有重要的應(yīng)用。更重要的是，由于微反應(yīng)器具有對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行區(qū)室化的功能，不同基因型的細(xì)胞可以在微反應(yīng)器中獨(dú)立地進(jìn)行生理活動(dòng)，產(chǎn)生的分泌型代謝產(chǎn)物在各自的微反應(yīng)器中積累而不會(huì)相互干擾，因此液滴微流控技術(shù)特別適用于對(duì)分泌型代謝產(chǎn)物進(jìn)行精確的定量，比常規(guī)的單細(xì)胞生物傳感器具有更為廣闊的應(yīng)用范圍。如在重要工業(yè)酶蛋白的生產(chǎn)菌株產(chǎn)量優(yōu)化方面，Sjostrom等［62］對(duì)表達(dá)α-淀粉酶的酵母菌株進(jìn)行了紫外誘變，并利用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行了篩選，最終獲得了α-淀粉酶表達(dá)量提高兩倍的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株。在此基礎(chǔ)上，Huang等［63］通過進(jìn)一步篩選獲得了表達(dá)量提高6倍的菌株，并結(jié)合全基因組超高通量測序技術(shù)，鑒定出了突變菌株基因組中與蛋白高分泌表達(dá)相關(guān)的330個(gè)基因。這將有助于加深人們對(duì)酵母中蛋白質(zhì)合成與分泌的生理生化機(jī)制的進(jìn)一步理解，進(jìn)而促進(jìn)高效蛋白質(zhì)合成途徑的理性構(gòu)建。在對(duì)分泌型小分子代謝產(chǎn)物的表達(dá)量進(jìn)行定量和篩選方面，Wang等［36］分別利用液滴微流控篩選平臺(tái)開發(fā)了針對(duì)酵母菌株胞外木糖消耗能力和大腸肝菌分泌生產(chǎn)乳酸能力的篩選方法。該技術(shù)平臺(tái)首先將單細(xì)胞工程菌連同培養(yǎng)基包裹在微反應(yīng)器中，不同的微反應(yīng)器經(jīng)過2 d的孵育進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，呈現(xiàn)了不同的營養(yǎng)物質(zhì)消耗及代謝產(chǎn)物分泌狀態(tài)。通過與包含熒光探針的檢測試劑進(jìn)行融合，能夠?qū)ξ⒎磻?yīng)器中木糖、乳酸等目標(biāo)檢測物進(jìn)行定量分析，幫助篩選得到具有符合預(yù)期生物活性的菌株。作者利用該體系，成功地鑒定出了決定木糖高消耗性狀的關(guān)鍵基因型［36］，并為進(jìn)行其它小分子代謝產(chǎn)物的檢測與篩選指明了方向。

表2總結(jié)了利用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行代謝途徑或全基因組定向進(jìn)化的實(shí)例（截至2016年9月）。值得注意的是目前液滴微流控技術(shù)在合成生物學(xué)篩選方面的應(yīng)用主要集中于方法體系的建立，而對(duì)代謝通路進(jìn)行實(shí)際篩選的實(shí)例仍較少。隨著該體系的進(jìn)一步成熟，將會(huì)產(chǎn)生越來越多的合成生物學(xué)應(yīng)用實(shí)例。

表2 液滴微流控技術(shù)酶性質(zhì)改造及新酶發(fā)現(xiàn)實(shí)例

5 展望

液滴微流控篩選體系以其超高通量、定量準(zhǔn)確、試劑消耗低等優(yōu)點(diǎn)，在酶催化元件、代謝途徑、乃至菌株的定向進(jìn)化方面體現(xiàn)了重要的應(yīng)用潛力，推動(dòng)了合成生物學(xué)的持續(xù)發(fā)展。近年來，多學(xué)科交叉技術(shù)的匯聚和融合，也使得液滴微流控篩選體系進(jìn)一步向縱深發(fā)展，如目前已可以在微流控芯片上進(jìn)行DNA片段組裝、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)、重組蛋白表達(dá)等復(fù)雜操作，這一方面大大減少了工作量，更有利于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，提升工作效率。另一方面，科學(xué)家們也嘗試將其它非標(biāo)記的檢測手段整合到液滴微流控體系中，以進(jìn)一步擴(kuò)展篩選體系的通用性，如質(zhì)譜（mass spectrometry）［65，66］、表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）［67］、小角度X射線衍射（small angle X-ray scattering，SAXS）［68］、熒光偏振（fluorescence anisotropy）［69］、熒光極化（fluorescence polarization）［70］、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis）［71］等，均已在微流控芯片的檢測上取得相當(dāng)大的進(jìn)展?？梢灶A(yù)見，隨著這些新技術(shù)體系的發(fā)展成熟，液滴微流控篩選將在合成生物學(xué)中發(fā)揮越來越大的作用，從而極大地加速生物能源、生物材料、平臺(tái)化學(xué)品、天然產(chǎn)物等重要產(chǎn)品的品種創(chuàng)新與高效制造。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Ultra-high-throughput Screening System Based on Droplet Microfluidics and Its Applications in Synthetic Biology

MA Fu-qiang1YANG Guang-yu1，2
（1. School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240；2. Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

The construction of a highly efficient synthetic biological system requires laborious screening work to optimize the performance of artificial system. Droplet microfluidic techniques miniaturize traditional screening systems，in a uniform pico-liter micro-reactors，the detection of enzymatic reactions and metabolites at single-cell level were measured and screened，thus it can screen genes/cells at a speed up to ＞108events per day，which greatly improves the optimizing capability of catalytic parts and engineered strains. Herein，the technical backgrounds while applying droplet microfluidics in synthetic biology system are summarized，focusing on the fluorescence-coupling strategies in the detection of target enzyme reactions and metabolites. Moreover，recent progress on employing droplet microfluidics in the screening and engineering of catalytic parts and metabolic pathways is reviewed，the developing trends of this field are discussed.

droplet microfluidics；synthetic biology；metabolic pathway；enzyme；high-throughput screening

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.009

2016-10-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470788，31100611）

馬富強(qiáng)，男，博士，研究方向：分子酶學(xué)及合成生物學(xué)；E-mail：mafuqiang318@sina.com

楊廣宇，男，博士，副研究員，研究方向：分子酶學(xué)及合成生物學(xué)；E-mail：yanggy@sjtu.edu.cn