陳小燕　吳應(yīng)強(qiáng)　朱蓉

【摘要】 目的：觀察阿司匹林對(duì)人結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44的影響，以探討其對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的作用。方法：Western blot檢測(cè)不同濃度阿司匹林作用后CD44在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480中的表達(dá)情況。結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480中均有表達(dá)，阿司匹林能降低HT-29和SW480中CD44蛋白的表達(dá)，并具有良好的量-效關(guān)系（P<0.05）；兩種細(xì)胞中CD44蛋白的表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：阿司匹林能降低結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480中CD44的表達(dá)，并對(duì)結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞有抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 阿司匹林； 結(jié)直腸癌； 腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物； CD44； HT-29； SW480

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Aspirin on the expression of cancer stem cell marker CD44 in human colon cancer.Method：Western blot was used to detect the expression of CD44 in human colon cancer cell line HT-29 and SW480 after different concentrations of Aspirin.Result：Western blot showed that cancer stem cell marker CD44 expression in both HT-29 and SW480 human colon cancer cell lines，Aspirin could reduce the expression of CD44 HT-29 and SW480，it had a good dose-response relationship（P<0.05）.The expression of CD44 protein in two cells showed no significant difference（P>0.05）.Conclusion：Aspirin can reduce the expression of CD44 in colon cancer cell line HT-29 and SW480，inhibit the proliferation of colon cancer stem cells.

【Key words】 Aspirin； Colorectal cancer； Cancer stem cell marker； CD44； HT-29； SW480

First-authors address：The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563099，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.001

結(jié)直腸癌是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因[1]。腫瘤干細(xì)胞雖然只占結(jié)直腸癌組織一小部分，但其具有自我更新的能力，并在腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用，因而是腫瘤根治的靶點(diǎn)。CD44是Wnt通路的靶基因[2]，CD44在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，可作為結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物[3-4]，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。非甾體抗炎藥（NSAIDs）阿司匹林因具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用，在臨床十分常用，且研究顯示可以通過降低腺瘤和結(jié)直腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，從而有效預(yù)防結(jié)直腸癌發(fā)生[5]，抑制甚至逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌癌前病變，延長患者的壽命[6]。本研究小組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿司匹林可顯著降低HT-29（COX-2高表達(dá)）、SW-480（COX-2陰性表達(dá)）細(xì)胞系中的腫瘤標(biāo)志物CD133、Lgr5的表達(dá)[7-8]。阿司匹林對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44有何影響，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究阿司匹林對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW-480中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44表達(dá)影響，進(jìn)一步探討阿司匹林預(yù)防結(jié)直腸癌發(fā)生的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株HT-29和SW-480人結(jié)腸癌細(xì)胞株。

1.2 主要試劑 McCoyS 5a培養(yǎng)基、胰蛋白酶及阿司匹林（美國Sigma公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒及RIPA裂解液（武漢博士德公司），辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG及小鼠抗人β-actin（北京中杉金橋公司），小鼠抗人CD44單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 用10%胎牛血清的McCoyS 5a培養(yǎng)基培養(yǎng)HT-29、SW480細(xì)胞株，置于37 ℃，

5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至80%～90%融合時(shí)，用細(xì)胞消化夜進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)、生長狀態(tài)良好時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Western blot檢查HT-29、SW-480細(xì)胞中CD44表達(dá) 將HT-29、SW480細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的阿司匹林（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記為對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組。收集各濃度處理后的細(xì)胞，按RIPA方案提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，定量上樣后電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h。加入小鼠抗人CD44單克隆抗體、小鼠抗人β-actin一抗，4 ℃過夜，0.1% TBST漂洗10 min×3次，于室溫與辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育1 h，0.1% TBST漂洗漂洗10 min×3次。應(yīng)用Luminol顯色，暗室X線膠片曝光拍照，用凝膠圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組內(nèi)的比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，在HT-29和SW480細(xì)胞中，各組的CD44蛋白印記條帶顏色由深到淺，見圖1。在HT-29細(xì)胞中，CD44蛋白的校準(zhǔn)值均低于對(duì)照組；SW480細(xì)胞中，CD44校準(zhǔn)值均亦低于對(duì)照組，各濃度組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。兩種細(xì)胞的組間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

3 討論

目前，腫瘤干細(xì)胞理論的提出為腫瘤研究提供了新的方向，腫瘤干細(xì)胞主導(dǎo)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移[9]。干細(xì)胞亞群增多使腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的抵抗能力增強(qiáng)，導(dǎo)致了腫瘤復(fù)發(fā)以及癌癥死亡率增高等[10]，因此，腫瘤干細(xì)胞可作為徹底根治腫瘤的靶點(diǎn)[11]。

細(xì)胞表面跨膜糖蛋白分子CD44是粘附分子中重要成員，在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞以及在結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤中分布，主要參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間的特異性粘連過程。CD44根據(jù)其外顯子的轉(zhuǎn)錄片段是否參與選擇性拼接，可分成CD44s和CD44v。CD44v主要功能體現(xiàn)在機(jī)體的病理過程中，尤其是CD44v6[12]和CD44v9[13]，可以使腫瘤侵襲能力上升，可能是因?yàn)槠涓淖兞四[瘤細(xì)胞表面粘附分子的構(gòu)成和功能。

CD44作為結(jié)直腸癌干細(xì)胞的標(biāo)志物得到了有關(guān)學(xué)者的證實(shí)，Wang等[14]通過分選出人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620中CD44+CD133-的細(xì)胞，其更好的代表了結(jié)腸癌干細(xì)胞，因其具有集落形成、增殖力強(qiáng)、抗凋亡以及誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥等干細(xì)胞的特性。Du等[15]研究顯示從結(jié)腸癌患者分離出的CD44+腫瘤細(xì)胞，僅需100個(gè)就能夠發(fā)展成異質(zhì)性腫瘤，而且由單個(gè)CD44+腫瘤細(xì)胞形成的球體具有腫瘤細(xì)胞的多種層次結(jié)構(gòu)。這些研究表明CD44是結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞最重要的表面生物學(xué)標(biāo)志物之一，結(jié)直腸癌中，CD44顯著表達(dá)[16-18]，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。Chai等[17]運(yùn)用免疫組化檢測(cè)CD44在145例不同病理類型標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果顯示CD44在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率為95.65%，顯著高于正常黏膜5%、炎性增生性息肉22.58%、管狀腺瘤性息肉55.26%及絨毛狀息肉75.76%，CD44表達(dá)強(qiáng)度與腸息肉癌變進(jìn)展呈正相關(guān)。Jing等[3]研究結(jié)果指出結(jié)腸癌伴肝轉(zhuǎn)移時(shí)，CD44基因表達(dá)量最高，其次是結(jié)腸癌和正常黏膜，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD44基因表達(dá)量與腫瘤位置、組織學(xué)有關(guān)，這與Du的研究結(jié)果不謀而合[15]，并提出CD44可以作為用于預(yù)測(cè)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移及判斷結(jié)腸癌患者生存率更可靠的標(biāo)記物。Bendardaf等[19]研究發(fā)現(xiàn)CD44s和CD44v6在結(jié)直腸中高表達(dá)，原發(fā)腫瘤比轉(zhuǎn)移瘤更高，這點(diǎn)與Hong的研究結(jié)果相似，轉(zhuǎn)移瘤中CD44s的表達(dá)程度與腫瘤組織學(xué)分級(jí)和原發(fā)腫瘤的侵襲性成正相關(guān)，與無病生存期成反比。Du等[20]研究表明CD44+腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)朊病毒蛋白（PrPc）而增強(qiáng)結(jié)腸腸癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。此外，有研究顯示CD44基因微小RNA結(jié)合位點(diǎn)的功能性遺傳變異可以中國人群罹患結(jié)直腸癌的遺傳易感性[21]。有關(guān)于CD44與結(jié)腸癌患者生存期的關(guān)系問題，也有學(xué)者提出了不一樣的觀點(diǎn)，即CD44表達(dá)和患者的總生存期或無病生存期之間沒有相關(guān)性[22-23]，甚至呈負(fù)相關(guān)[18]，可能是由于腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響取決于腫瘤的病理分型。

一系列研究均表明服用阿司匹林等NSAIDs可以降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，改善患者預(yù)后，減少術(shù)后復(fù)發(fā)率以及降低癌癥死亡風(fēng)險(xiǎn)等[24]。本小組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿司匹林均能顯著降低人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、SW-480中腫瘤標(biāo)志物CD133、Lgr5的表達(dá)，從而抑制腫瘤干細(xì)胞，其機(jī)制主要涉及機(jī)制COX-2途徑和非COX-2途徑，且以非COX-2途徑為主。然而其對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44有何影響尚不清楚，需待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示HT-29、SW-480細(xì)胞株中均表達(dá)CD44，Muraro等[25]研究結(jié)果與此一致。此外，隨著阿司匹林濃度的增加，HT-29和SW480細(xì)胞中CD44的表達(dá)明顯減少，并呈量-效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。有研究表明阿司匹林等NSAIDs可能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而干預(yù)癌癥發(fā)生的初始步驟[26]。阿司匹林等NSAIDs可以減弱β-catenin/TCF敏感基因CD44的轉(zhuǎn)錄，并呈量效關(guān)系[26]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不謀而合。Zeilstra等[27]研究亦顯示與CD+/+/ApcMin/+小鼠比較而言，CD44-/-/ApcMin/+小鼠通過促進(jìn)隱窩基底部上皮細(xì)胞的凋亡從而減少了50%的結(jié)腸腺瘤發(fā)生率，此研究表明，CD44在腸道腫瘤的發(fā)生中起了重要作用，同時(shí)也表明CD44并不影響細(xì)胞增殖而是維持腸道隱窩細(xì)胞凋亡與生長之間的平衡。CD44表達(dá)降低不僅可以降低結(jié)腸癌的發(fā)生，而且可以減少結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[28]。CD44在腸上皮細(xì)胞及結(jié)直腸癌的表達(dá)是不依賴于p53，由此表明CD44可以作為結(jié)直腸癌治療的靶點(diǎn)[29]。

綜上所述，公認(rèn)的結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44在結(jié)腸癌中大量表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、分期和腫瘤部位等密切相關(guān)，反應(yīng)了腸息肉癌變進(jìn)展過程，可以獨(dú)立判斷患者預(yù)后[30-32]。本研究結(jié)果表明阿司匹林可抑制CD44的表達(dá)，可能是通過削弱CD44介導(dǎo)的Wnt信號(hào)而抑制腫瘤干細(xì)胞，從而起到防治結(jié)直腸癌的作用，為阿司匹林預(yù)防結(jié)直腸癌提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2016-09-19） （本文編輯：周亞杰）