韓端丹

（武漢東湖學(xué)院 湖北武漢 430077）

花木害蟲粉紋夜蛾抗生物農(nóng)藥Bt抗性機(jī)制的研究進(jìn)展

韓端丹

（武漢東湖學(xué)院 湖北武漢 430077）

蘇云金芽孢桿菌（Bt）產(chǎn)生的伴孢晶體蛋白（Cry毒素）具殺蟲活性，對昆蟲有高度選擇性而對人畜無害，已開發(fā)成生物農(nóng)藥廣泛使用。隨著Bt農(nóng)藥全世界大量，應(yīng)用，部分昆蟲產(chǎn)生了抗藥性。粉紋夜蛾在我國廣泛分布且危害較大，已發(fā)現(xiàn)其對Bt農(nóng)藥和轉(zhuǎn)Bt基因植物產(chǎn)生抗性。本文比較粉紋夜蛾抗Bt毒素細(xì)胞與敏感細(xì)胞的各項(xiàng)差異，應(yīng)用蛋白組學(xué)和mRNA組學(xué)的方法技術(shù)，分析發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞與抗性細(xì)胞的大部分差異蛋白，都與糖蛋白、胞質(zhì)結(jié)合蛋白、脂蛋白、脂多糖蛋白相關(guān)，提示昆蟲對Bt抗性的形成可能與膜蛋白有關(guān)。

粉紋夜蛾；Bt；抗性；Cry 毒素

蘇云金芽孢桿菌，簡稱Bt，產(chǎn)生的伴孢晶體具有殺蟲活性，其活性成分是一種晶體蛋白，即Cry毒素。這種Bt毒素具有高度選擇性，對昆蟲可致病致死而對人畜無害，目前已開發(fā)成生物農(nóng)藥在全世界廣泛使用[1]。但隨著Bt農(nóng)藥大量長時(shí)間應(yīng)用，一些昆蟲對其產(chǎn)生了一定抗性。粉紋夜蛾作為一類鱗翅目昆蟲，在我國廣泛分布，對棉花、茄子、麻等農(nóng)作物有較大危害。發(fā)現(xiàn)粉紋夜蛾已對Bt藥劑及一些轉(zhuǎn)Bt基因植物產(chǎn)生了抗性，因此粉紋夜蛾成為研究昆蟲對Bt農(nóng)藥抗性形成機(jī)制的一個(gè)代表。粉紋夜蛾的抗性比是可變的，開始時(shí)抗性很高，但一段時(shí)間不經(jīng)篩選后其抗性開始急劇下降。本文比較粉紋夜蛾抗Bt毒素細(xì)胞與敏感細(xì)胞的各項(xiàng)差異，為研究粉紋夜蛾抗Bt機(jī)制的形成提供參考。

由于不同昆蟲對Bt產(chǎn)生的抗性比及抗性形成機(jī)制不同，昆蟲抗Bt的機(jī)制很復(fù)雜，進(jìn)行相關(guān)抗性研究也比較困難。為研究粉紋夜蛾抗性機(jī)理的產(chǎn)生，本文將粉紋夜蛾粉抗Bt毒素細(xì)胞與敏感細(xì)胞的在蛋白質(zhì)差異上的一些指標(biāo)進(jìn)行比較，如mRNA的差異、蛋白組學(xué)的差異及分子生物學(xué)方面的差異等。

1 Bt殺蟲機(jī)制與粉紋夜蛾對Bt抗性的產(chǎn)生

Bt殺蟲作用是通過它針對不同昆蟲產(chǎn)生不同特異性的伴孢晶體。Bt所產(chǎn)生的殺蟲蛋白晶體（insecticidal crystal proteins，ICPs）是一種原毒素，需中腸胰蛋白酶作用，經(jīng)剪切而激活[2]。粉紋夜蛾吃了Bt藥劑或轉(zhuǎn)Bt基因植物后，ICPs會(huì)在其中腸液內(nèi)溶解，然后被活化，再與中腸上皮細(xì)胞的受體結(jié)合，導(dǎo)致中腸上的膜穿孔發(fā)生生理性的病變或者破壞鈉離子泵、鉀離子泵，導(dǎo)致機(jī)體的紊亂，引起細(xì)胞膜的去極化，導(dǎo)致細(xì)胞的裂解，從而損傷蟲體而致死。而人和哺乳動(dòng)物腸上皮細(xì)胞缺乏那樣的受體，因此Bt農(nóng)藥對人畜無害，不污染環(huán)境[3]。

長時(shí)間以來，通過噴灑混合Bt的藥劑和種植各種轉(zhuǎn)Bt的轉(zhuǎn)基因植物來控制害蟲對農(nóng)作物的損害，但隨著越來越多昆蟲對Bt產(chǎn)生抗性，探究昆蟲抗Bt的機(jī)制就成為迫切需要。粉紋夜蛾對Bt的Cry毒素產(chǎn)生抗性，經(jīng)過7代選擇后產(chǎn)生的抗性倍數(shù)是31。1996年我國從美國孟山公司引進(jìn)能表達(dá)Cry毒素的轉(zhuǎn)基因Bt棉，開始時(shí)Bt毒素能有效控制粉紋夜蛾等害蟲[4]，但長期使用后害蟲卻逐漸對Bt棉產(chǎn)生了抗性。Bt殺蟲蛋白晶體在蟲體內(nèi)可能經(jīng)晶體的溶解、原毒素的活化、穿過食圍膜、毒素與中腸上皮細(xì)胞的結(jié)合、孔的形成、細(xì)胞的裂解以及中腸完整性遭到破壞等過程，最后導(dǎo)致昆蟲致病直至死亡，而與之對應(yīng)的抗性機(jī)制的產(chǎn)生則可能有昆蟲拒食、pH值或還原電位的降低、中腸蛋白酶活性的降低、蛋白酶降低Cry毒素與中腸上皮細(xì)胞受體的結(jié)合力與親和性、將活化的毒素稀釋降低其毒性的毒力、中腸上皮細(xì)胞分裂加速，修復(fù)能力增強(qiáng)等等[5]。

2 粉紋夜蛾抗Bt毒素細(xì)胞與敏感細(xì)胞蛋白組的差異

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，是生物體內(nèi)行使功能的重要單位。研究粉紋夜蛾敏感細(xì)胞、抗性細(xì)胞、抗性衰退細(xì)胞的蛋白質(zhì)上的差異對了解抗Bt機(jī)制的形成很有必要，可以通過蛋白質(zhì)的差別了解抗性細(xì)胞和敏感細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、功能上的差異。

為比較粉紋夜蛾抗Bt毒素細(xì)胞與敏感細(xì)胞的蛋白組的差異，采用雙向電泳、高效液相色譜及毛細(xì)管電泳等研究方法，結(jié)果顯示3個(gè)蛋白質(zhì)是抗性細(xì)胞特有的，這3個(gè)蛋白為鞭毛驅(qū)動(dòng)蛋白及脂多糖生物合成蛋白等，可能都與抗性形成相關(guān)。通過雙向電泳、肽質(zhì)量指紋圖譜及凝膠圖像分析來研究粉紋夜蛾敏感細(xì)胞與抗Bt毒素細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)上的差異，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞在胞質(zhì)結(jié)合蛋白、磷酸鹽結(jié)合蛋白這兩種蛋白上存在差異。此外在蛋白表達(dá)量上，敏感細(xì)胞與抗性細(xì)胞表達(dá)差異顯著的有7個(gè)。通過肽質(zhì)指紋圖譜鑒定及應(yīng)用相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫、mRNA差異顯示等方法，對差異蛋白質(zhì)在DIP、INTERACT、ProNet等數(shù)據(jù)庫中分析比較與其他蛋白質(zhì)之間的同源性，發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞與抗性細(xì)胞大部分的差異蛋白，都與糖蛋白、胞質(zhì)結(jié)合蛋白、脂蛋白、脂多糖蛋白相關(guān)，提示粉紋夜蛾對Bt抗性的形成與膜蛋白有關(guān)。

基于上述研究成果，可以看出粉紋夜蛾抗Bt的機(jī)制非常復(fù)雜，并不是用單一原因就可以完全解釋清楚，可以肯定抗性的形成機(jī)制有多個(gè)方面。這其中可能涉及到基因的表達(dá)、沉默及開閉，膜蛋白影響毒素與膜上受體的結(jié)合，以及毒素的激活和降解等。綜合上述這些研究結(jié)果，可以從分子生物學(xué)角度上初步解釋粉紋夜蛾抗Bt的抗性機(jī)制產(chǎn)生的分子機(jī)理。

[1]弓愛君，孫翠霞，丘麗娜，等編著.BT生物農(nóng)藥[J].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006，6.

[2]喻子牛.蘇云金芽胞桿菌制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用[M].農(nóng)業(yè)出版社，1993：30～58.

[3]喻子牛，主編.蘇云金桿菌[M]，北京：科學(xué)出版社，1990：305～323.

[4]劉子鐸，喻子牛.蘇云金芽孢桿菌及其殺蟲晶體蛋白作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2000，43（2）：207～213.

[5]喻子牛，孫明，劉子鐸，等.蘇云金芽孢桿菌的分類及生物活性蛋白基因[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，1996，12（2）：85～89.

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1005-7897（2017）20-0207-02

2017-9-20

韓端丹（1980-），女，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與生物制藥。