孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松對(duì)支氣管哮喘患者Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

馮秀麗+丁昌俊

[摘要]目的 觀察口服孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松吸入治療對(duì)支氣管哮喘患者體內(nèi)輔助性T（Th）17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素（IL）-17和IL-23表達(dá)的影響。方法 將2014年10月～2016年4月在本院住院及門(mén)診就診診斷為支氣管哮喘的60例患者按照不同的治療方法分為常規(guī)治療組20例和孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松組40例，同時(shí)納入健康對(duì)照組20例。分別于入院或門(mén)診就診治療后3個(gè)月采用ELISA法檢測(cè)所有患者空腹血清及痰培養(yǎng)上清中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、IL-17和IL-23表達(dá)的變化。結(jié)果 與健康對(duì)照組比較，哮喘患者血清及痰培養(yǎng)上清中TGF-β、IL-17和IL-23表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。治療后3個(gè)月，兩組患者TGF-β、IL-23表達(dá)水平較治療前顯著降低（P<0.05）；與常規(guī)治療組比較，孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松組血清TGF-β、IL-23表達(dá)水平下降更為顯著（P<0.05）。兩組患者血清和痰培養(yǎng)上清中IL-17表達(dá)水平治療前后無(wú)顯著改變（P>0.05）。結(jié)論 Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子參與哮喘的發(fā)病；孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松治療可顯著降低支氣管哮喘患者Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]支氣管哮喘；Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子；孟魯司特；沙美特羅替卡松

[中圖分類(lèi)號(hào)] R562.2+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）11（c）-0027-04

[Abstract]Objective To observe effect of oral Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone inhalation on experssion levels of cytokines related to T helper （Th） 17 cells transforming growth factor beta （TGF- beta），interleukin （IL）-17 and IL-23 in patients with new-onset bronchial asthma.Methods According to different treatment methods， sixty patient with new-onset bronchial asthma admitted into our hospital from October 2014 to April 2016 were divided into routine treatment group（n=20） and Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone group whom received Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone （n=40）.Another 20 health people were selected as healthy group.The serum and sputum supernatan levels of inflammatory factors such as TGF-β，IL-17 and IL-23 were measured by ELISA before and after outpatient treatment for 3 months.Results Compared with healthy group，the serum and sputum supernatan levels of inflammatory factors such as TGF-β，IL-17 and IL-23 was higher that in the routine treatment group and the Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone group，and the difference was statistically significant （P<0.01）.After treatment for 3 months，the expression level TGF-β and IL-23 of two groups was significantly lower than that before treatment （P<0.05）；compared with routine treatment group，expression levels of serum TGF-β and IL-23 in the Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone group decreased significantly （P<0.05）.There was no significant change in the expression of IL-17 in the serum and sputum supernatant of two groups before and after treatment for 3 months （P>0.05）.Conclusion Cytokines related cytokines Th17 cells may play important roles in the development of asthma，and using of Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone can inhibit the experssion of cytokines related to Th17 in patients with asthma.

[Key words]Bronchial asthma；Cytokines related to Th17 cells；Montelukast；Salmeterol Fluticasone

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是由多種細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的呼吸道慢性炎癥性和呼吸道高反應(yīng)性為特征疾患，因治療不足導(dǎo)致死亡率居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界目前大約有3億哮喘患者，我國(guó)約有3000萬(wàn)哮喘患者并逐年增加。最新兒童哮喘國(guó)際共識(shí)指出，盡管目前使用激素、β受體激動(dòng)劑等現(xiàn)有有效方法治療，全球仍有50%的兒童哮喘得不到控制[1]。過(guò)去一直用“Th1/Th2失衡學(xué)說(shuō)”來(lái)解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制[2]，但是越來(lái)越多的證據(jù)表明，Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)并不單純受Th1和Th2自身的影響。Th17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的CD4+輔助性T細(xì)胞亞群，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL-23在慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。本研究進(jìn)一步探討Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在哮喘患者中的表達(dá)水平及孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松治療后的表達(dá)變化。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年10月～2016年4月在我院呼吸科門(mén)診和住院新近確診的60例支氣管哮喘患者為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲，無(wú)性別限制；②根據(jù)GINA（2009版）明確診斷為支氣管哮喘，且發(fā)病時(shí)間<1年，F(xiàn)EV1%≥60%的輕中度持續(xù)哮喘患者；③未使用吸入性糖皮質(zhì)激素治療；④知情同意后參加研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：凡有下列情況之一者，不作為入選病例。①既往有吸煙史；②肝功能、腎功能、心功能不全患者，或合并其他臟器嚴(yán)重疾??；③排除其他肺部疾?。ㄈ鏑OPD、支氣管及肺部腫瘤）。其中男39例，女21例；年齡（47.91±4.32）歲。將60例患者按照不同的治療方法分為常規(guī)治療組20例和孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松組40例，兩組患者年齡、性別、病情等資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

同時(shí)納入20例我院健康體檢人群作為健康對(duì)照組，其中男13例，女7例；年齡（45.23±3.77）歲，排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有慢性肺部疾病、過(guò)敏性疾病人群；②具有哮喘家族史者；③1個(gè)月內(nèi)無(wú)急性上呼吸道感染和或肺部感染病史；④無(wú)糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑應(yīng)用史。

1.2方法

1.2.1給藥方法 常規(guī)治療組給予常規(guī)對(duì)癥支持治療，即進(jìn)行吸氧、吸痰、抗感染、靜脈輸液等綜合治療。口服孟魯司特（魯南貝特制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20083372）聯(lián)合沙美特羅替卡松（Glaxo Operations UK Limited，批準(zhǔn)文號(hào)：H20140165）組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用沙美特羅替卡松（舒利迭）每次50/250 μg，bid，聯(lián)合口服孟魯司特10 mg，qd，并進(jìn)行為期3個(gè)月的隨訪。分別收集治療前及規(guī)范治療3個(gè)月后兩組患者誘導(dǎo)痰及外周血血清。

1.2.2誘導(dǎo)痰及血清的收集 所有研究對(duì)象均采用等滲鹽水沖洗口腔，后吸入沙丁胺醇200 μg，3.0%高滲鹽水10 ml超聲霧化吸入進(jìn)行痰誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)過(guò)程中受試者如出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難、咳嗽則隨時(shí)停止。分別測(cè)定誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)期間FEV1%。收集痰標(biāo)本后以4倍痰液體積的1%二硫蘇糖醇對(duì)痰進(jìn)行處理，2000 r/min離心10 min，收集上清液保存于-20℃。收集清晨空腹肘靜脈血清，靜置20 min后3000 r/min離心15 min，收集血清保存于-20℃。

1.2.3 Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、IL-17和IL-23檢測(cè) 應(yīng)用北京美迪科生物技術(shù)有限公司提供的放射免疫試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定誘導(dǎo)痰及空腹血清中TGF-β、IL-17和IL-23水平，具體操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1治療前后兩組患者血清Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化

治療前，兩組哮喘患者血清TGF-β、IL-17和IL-23表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。治療后3個(gè)月，兩組患者血清TGF-β、IL-23表達(dá)較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中口服孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松組下降更明顯，與常規(guī)治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組治療后IL-17表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P>0.05）（表1）。

2.2治療前后患者誘導(dǎo)痰上清液中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化

口服孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松組治療前，新發(fā)哮喘患者痰培養(yǎng)上清中TGF-β、IL-17和IL-23表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。治療后3個(gè)月，常規(guī)治療組和孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松組患者痰培養(yǎng)上清液中TGF-β、IL-23表達(dá)較治療前顯著降低，其中孟魯司特聯(lián)合沙美特羅氟替卡松組下降更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療前后兩組IL-17表達(dá)水平均無(wú)明顯變化（P>0.05）（表2）。

3討論

哮喘是一種慢性氣道變應(yīng)性疾病，CD4+T細(xì)胞的過(guò)度活化在哮喘的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵的樞紐作用。過(guò)去一直用“Th1/Th2失衡學(xué)說(shuō)”來(lái)解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制[3]，但是越來(lái)越多的證據(jù)表明，Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)并不單純受Th1和Th2自身的影響。在臨床上，也沒(méi)有足夠的證據(jù)證明用Th1細(xì)胞因子可以有效地治療哮喘。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道即使用大量抗原特異性Th1細(xì)胞干預(yù)并不能使Th2細(xì)胞誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性得到控制[3-4]。Th17細(xì)胞是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的不同于Thl和Th2的另一種CD4+T細(xì)胞亞群，其相關(guān)的細(xì)胞因子主要包括TGF-β、IL-17和IL-23。TGF-β可誘導(dǎo)CD4+初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究證實(shí)TGF-β缺乏小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞比例顯著降低[5-7]；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可直接促進(jìn)氣道間質(zhì)細(xì)胞及上皮細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白ECM表達(dá)，促進(jìn)氣道平滑肌中纖維蛋白沉積致氣道壁增厚進(jìn)而促進(jìn)氣道重構(gòu)[8-9]。IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的一種最主要炎癥細(xì)胞因子，其參與哮喘發(fā)病主要通過(guò)募集氣道嗜酸粒細(xì)胞聚集浸潤(rùn)于氣道局部，促進(jìn)氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生[10-11]。IL-23在維持Th17細(xì)胞穩(wěn)定以及誘導(dǎo)其增殖方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示IL-23缺乏可減少氣道局部嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而改善氣道炎癥預(yù)防哮喘發(fā)生[12]。

本研究通過(guò)觀察新發(fā)支氣管哮喘經(jīng)孟魯司特聯(lián)合沙美特羅氟替卡吸入治療3個(gè)月后Th17相關(guān)細(xì)胞因子變化，進(jìn)一步探討Th17細(xì)胞相關(guān)因子在哮喘發(fā)病過(guò)程中的作用及抗炎治療對(duì)其的影響。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，哮喘患者血清及痰培養(yǎng)上清中TGF-β、IL-17和IL-23表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與蔣鯤等[13]的研究結(jié)果一致。這提示Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子分泌是參與哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。經(jīng)孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松治療后，患者血清和痰培養(yǎng)上清中TGF-β、IL-23表達(dá)較治療前顯著降低，且顯著低于常規(guī)治療組，可見(jiàn)早期給予孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松治療對(duì)氣道重塑干預(yù)效果顯著，這為臨床早期孟魯司特聯(lián)合沙美特羅替卡松治療哮喘提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。血清和痰培養(yǎng)上清液中IL-17表達(dá)水平在治療前后均無(wú)顯著變化，這與筆者預(yù)期的研究結(jié)果不一致，考慮IL-17在哮喘發(fā)病中作用復(fù)雜[14]。研究報(bào)道IL-17在炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有雙向調(diào)節(jié)作用，IL-17在過(guò)敏性哮喘的建立過(guò)程中起正性調(diào)節(jié)作用[15-16]。在哮喘的致敏過(guò)程中IL-17又具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，因此針對(duì)IL-17在哮喘發(fā)病中的具體作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步更基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。本研究樣本量較少，且觀察時(shí)間較短，并未進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，因此關(guān)于Th17細(xì)胞相關(guān)因子對(duì)哮喘發(fā)病中的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-10-17 本文編輯：方菊花）