陳功+馮濤

【摘要】 目的：探討長托寧對大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎所致神經(jīng)病理性疼痛模型的影響。方法：清潔級SD雄性大鼠60只，6～8周齡，質(zhì)量150～180 g，采用隨機數(shù)字表法，將其分為三組，假手術(shù)組（S組）、對照組（C組）和長托寧組（P組），每組各20只。假手術(shù)組分離暴露腰五神經(jīng)但不結(jié)扎；對照組結(jié)扎腰五神經(jīng)；長托寧組術(shù)前肌注長托寧0.07 mg/kg，結(jié)扎腰五神經(jīng)，術(shù)后肌注長托寧0.07 mg/（kg·d），連續(xù)6 d。術(shù)后第7﹑32天進(jìn)行機械性痛閾和熱痛閾檢測，取結(jié)扎處神經(jīng)組織ELISA法檢測TNF-α和IL-6的水平。結(jié)果：術(shù)后第7天，C、P組術(shù)后機械性痛閾和熱痛閾均明顯低于S組（P<0.05），TNF-α和IL-6的水平均明顯高于S組（P<0.05）；P組術(shù)后機械性痛閾和熱痛閾均明顯高于C組（P<0.05），TNF-α和IL-6的水平均明顯低于C組（P<0.05）。術(shù)后第32天，C、P組各項指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：長托寧在神經(jīng)損傷早期給予，能延緩神經(jīng)損傷引起的病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程，其機制可能與長托寧能改善受損組織局部的微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)的作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 長托寧； 神經(jīng)病理性疼痛； 機械性痛閾； 熱痛閾

【Abstract】 Objective： To investigate the effects of Penehyclidine hydrochloride on rats neuropathic pain induced by spinal nerve ligation model.Method：Clean levels 30 male SD rats，6～8 weeks of age，150 to 180 g， were randomly divided into 3 groups，sham operation group （S group），control group （C group） and penehyclidine hydrochloride group （P group），20 rats in each group.The S group was exposed but not ligated five lumbar nerve；the C group was ligated five lumbar nerve；P group preoperative intramuscular injection of Penehyclidine hydrochloride 0.07 mg/kg，ligated five lumbar nerve ligation，after intramuscular injection of Penehyclidine hydrochloride 0.07 mg/（kg·d） for 6 days.The mechanical pain threshold and heat pain threshold were detected seventh days after operation，the ligation of nerve tissue TNF-α and IL-6 levels were detected by ELISA method.Result：Seventh days after operation，C group and P group after mechanical pain threshold and heat pain threshold was significantly lower than that of group S（P<0.05），TNF-α and IL-6 levels were significantly higher than that in S group（P<0.05）；P group after mechanical pain threshold and heat pain threshold were significantly higher than that in C group（P<0.05），TNF-α and IL-6 were significantly lower than C group.After thirty-second days，there was no significant difference between the C group and P group（P>0.05）.Conclusion：Penehyclidine hydrochloride in nerve injury early，can delay the occurrence and development process of neuropathic pain caused by nerve injury.The mechanism may be related to penehyclidine hydrochloride can improve microcirculation damaged tissues， reduce the inflammatory reaction.

【Key words】 Penehyclidine hydrochloride； Neuropathic pain； Mechanical threshold； TWL

First-authors address：Baoan Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.34.007

神經(jīng)病理性疼痛是指外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后引起的疼痛綜合征，它的特點是機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏[1]。鹽酸戊乙奎醚（penehyclidine hydrochloride，PHC）注射液，商品名為長托寧，為我國首創(chuàng)的新型抗膽堿藥，主要選擇性的阻斷M1、M3亞型膽堿受體，臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)該藥在改善微循環(huán)中的作用較好[2]。本研究擬通過建立脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠模型，觀察長托寧對神經(jīng)病理性疼痛的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔Ⅱ級雄性SD大鼠，6～8周齡，質(zhì)量150～180 g，由廣東醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。實驗室溫度為22～24 ℃，濕度40%～60%，周期光照8：00～20：00，所有處理遵照國際疼痛學(xué)會的倫理指導(dǎo)進(jìn)行[3]。

1.2 主要試劑和儀器 長托寧由成都力思特制藥有限公司提供，批號030722；機械性痛閾刺激儀和熱輻射刺激儀購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所；TNF-α和IL-6 ELISA法檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 按照文獻(xiàn)[4]方法，大鼠腹腔注射3%水合氯醛2 mL深麻醉后，以兩側(cè)骼骨最高點連線與背部中線相交處偏左側(cè)切開皮膚，切口長約2 cm ，分離皮下組織及肌肉，找到腰六的橫突并移除，暴露腰四及腰五神經(jīng)，小心分離腰五神經(jīng)，用絲線扎緊，觀察無明顯活動出血后逐層縫合肌肉皮膚。術(shù)畢腹腔注射氨節(jié)青霉素防止術(shù)后感染，將大鼠置于飼養(yǎng)籠中，注意保溫，水和食物供應(yīng)充足。

1.3.2 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為3組，假手術(shù)組（S組）、對照組（C組）和長托寧組（P組），每組各20只。假手術(shù)組分離暴露腰五神經(jīng)但不結(jié)扎；對照組結(jié)扎腰五神經(jīng)；長托寧組術(shù)前肌注長托寧0.07 mg/kg，結(jié)扎腰五神經(jīng)，術(shù)后肌注長托寧0.07 mg/（kg·d），連續(xù)6 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 機械性痛閾測定 將每組大鼠隨機分為兩組，每組10只，一組用于術(shù)后第7天觀察，另一組用于第32天觀察。采用Dixon[5]方法，將大鼠置入有機玻璃籠內(nèi)，籠子的底部為小格子金屬網(wǎng)，在測試開始前，先讓大鼠在籠子內(nèi)適應(yīng)10 min。選取一組vonfrey纖毛（編號為3.65，3.87，4.10，4.31，4.52，4.74，4.92和5.16；分別對應(yīng)0.45，0.74，1.26，2.04，3.31，5.50，8.32，和14.45 g）。從4.31號纖毛開始，用纖毛以垂直大鼠腳掌的方向刺激腳掌皮膚，力度以使纖毛微微彎曲為宜，刺激位置在大鼠第四第五腳趾之間的皮膚。大鼠在刺激當(dāng)時或刺激結(jié)束時出現(xiàn)抬足認(rèn)為陽性。如果出現(xiàn)陰性反應(yīng)，繼續(xù)選用下一個克數(shù)大的纖毛。如果出現(xiàn)陽性反應(yīng)，繼續(xù)選用下一個克數(shù)小的纖毛，以出現(xiàn)不同的反應(yīng)為始，連續(xù)測6次，并記錄結(jié)果。如果大鼠出現(xiàn)連續(xù)的陽性或陰性反應(yīng)，直至0.45 g和14.45 g纖毛，那么按vonfrey編號，分別認(rèn)定后一個編號5.28（18.72 g）或前一個編號3.54（0.34 g）為結(jié)果。

1.4.2 熱痛閾的測定 觀察大鼠在輻射熱照射下出現(xiàn)縮爪反射的潛伏時間作為熱痛閡。將每組大鼠隨機分為兩組，分別于術(shù)后第7﹑32天將大鼠放置于透明的有機玻璃籠中，籠子無底壁，將籠子放在一塊3 mm厚的玻璃板上，這樣動物的足底直接接觸玻璃板，而測定探頭緊挨著玻璃板的下面測定，減少系統(tǒng)誤差。照射源為8伏，50瓦的燈泡，內(nèi)有凹透鏡聚焦，外罩金屬外殼，上端有一直徑5 mm的孔，這樣燈泡離前端為40 mm。探頭連接精確計時器，計時期與照射源電源同步，記錄開始照射到出現(xiàn)縮爪反應(yīng)的時間區(qū)間。以大鼠在輻射熱照射下出現(xiàn)縮爪反射的潛伏時間作為熱痛閾，測定值精確到0.1 s，所有動物照射內(nèi)側(cè)第一足趾的著力點，每個時點測定3次，間隔15 min/次，取平均值為熱痛閾。單次照射時間不超過20 s，以免損傷照射部位[6]，所有測定由一個不知情的實驗人員在相同時間點和相同實驗條件下完成。

1.4.3 TNF-α和IL-6的檢測 進(jìn)行熱痛閾和機械性痛閾測定后，處死大鼠，取出結(jié)扎處腰五神經(jīng)，用4 ℃生理鹽水制成1%勻漿，按ELISA法操作說明，檢測TNF-α和IL-6的水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

術(shù)后第7天，與S組比較，C、P組機械性痛閾和熱痛閾均明顯降低（P<0.01），TNF-α和IL-6水平均明顯升高（P<0.01）；與C組比較，P組機械性痛閾和熱痛閾均明顯升高（P<0.05），TNF-α和IL-6水平均明顯降低（P<0.05）。術(shù)后第32天，C、P組機械性痛閾和熱痛閾均較S組明顯降低（P<0.01），而C、P組機械性痛閾、熱痛閾、TNF-α和IL-6水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1、2。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制并沒有完全清楚，目前還沒有好的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[7]。在外周神經(jīng)結(jié)扎后，華勒氏變性導(dǎo)致TNF-α生成，TNF-α是一種強有力的炎癥介質(zhì)，可激發(fā)中性粒細(xì)胞表達(dá)大量粘附分子，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分化，使其發(fā)生氧化爆發(fā)、脫顆粒、增強其吞噬功能，還可進(jìn)一步誘導(dǎo)自身和其他細(xì)胞因子（如IL-1、lL-6、IL-8等）的產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致神經(jīng)損傷的加重[8-10]。外周神經(jīng)損傷后產(chǎn)生的機械疼閾異常和熱痛覺過敏與受損部位或背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元自發(fā)和持續(xù)性地異常放電密切相關(guān)。外周神經(jīng)損傷引起的炎性物質(zhì)引起這種異常放電增加，進(jìn)一步加重疼痛的產(chǎn)生[11-12]。

局部組織損傷后的炎癥反應(yīng)和疼痛引起的血小板聚集和炎癥細(xì)胞浸潤將導(dǎo)致血液粘稠度增加，導(dǎo)致微循環(huán)障礙。而微循環(huán)障礙進(jìn)一步加重局部組織的缺血缺氧，從而加重?fù)p傷[13]。長托寧屬于抗膽堿藥物，與其他M膽堿受體阻斷藥物有相似的改善微循環(huán)障礙的作用，能夠緩解血瘀癥狀[14-15]。

本研究顯示，脊神經(jīng)結(jié)扎后第7天，連續(xù)給予長托寧的P組相對于未給予長托寧的C組，其神經(jīng)中TNF-α和IL-6水平明顯降低，機械性痛閾異常和熱痛閾過敏的現(xiàn)象得到明顯改善，說明長托寧能減輕炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)損傷。在術(shù)后第32天，再次對各組大鼠進(jìn)行觀察時，筆者發(fā)現(xiàn)P組和C組炎癥因子TNF-α和IL-6水平已大幅降低，兩組之間各項指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。其原因，筆者分析可能有兩點：第一：長托寧只在術(shù)后6 d連續(xù)給予，以后其作用慢慢消失；第二：長托寧雖然能改善受損組織局部的微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)，延緩神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程，但并不能改善神經(jīng)的損傷程度。具體原因，有待進(jìn)一步實驗驗證。

綜上所述，筆者認(rèn)為長托寧在神經(jīng)損傷早期給予，雖不能減輕神經(jīng)損傷引起的病理性疼痛，但能在一定程度上延緩神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程。其機制可能與長托寧能改善受損組織局部的微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)的作用有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]丘玥，陳唯韞，王之遙，等.辛伐他汀對大鼠神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)和RhoA通路表達(dá)的影響[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2016，22（7）：493-500.

[2]郭立峰.霧化吸入長托寧對COPD患者肺功能和微循環(huán)的影響[J].山東醫(yī)藥，2012，52（26）：83-84.

[3] Zimmermann M.Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals[J].Pain，1983，16（2）：109-110.

[4] Kim S H，Chung J M.An experimental model for Peripheral Neuropathy Produced by segmental spinal nerve ligation in the rat[J].Pain，1992，50（3）：355-363.

[5] Dixon W J.Efficient analysis of experimental observations[J].Annu Rev Pharmacol Toxieol，1980，20（20）：441-462.

[6] Hargreaves K，Dubner R，Brown F.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain，1988，32（l）：77-88.

[7]鐘敏，曾因明，柳垂亮，等.脊髓TNF-α、IL-1β和IL-6在神經(jīng)病理性疼痛過程中的表達(dá)變化[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2010，16（1）：42-44.

[8]梅厚連，羅天友.強痛定聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型促炎因子的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（19）：34-36.

[9]楊建軍，沈錦春，劉紅軍，等.加巴噴丁治療大鼠腰5神經(jīng)結(jié)扎后神經(jīng)病理性疼痛的療效及可能機制[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2010，23（5）：465-469.

[10]南興東，馮藝，張利萍.TNF-α在坐骨神經(jīng)冷凍致神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓的表達(dá)[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2012，18（1）：38-42.

[11]徐江濤，馬柯.神經(jīng)病理性疼痛中背根神經(jīng)節(jié)交感神經(jīng)芽生的機制研究[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2015，21（7）：481-485.

[12] Roza C，Laird J M，Souslova V，et al.The tetrodotoxin resistant Na+ channel Navl.8 is essential for the expression of spontaneous activity in damaged sensory axons of mice[J].J Physiol，2003，550（3）：921-926.

[13]趙麗倩，畢勝利.細(xì)胞黏附分子在危重病微循環(huán)障礙中的作用[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2014，24（1）：68-70.

[14]周開隆，何文真，李其斌，等.鹽酸戊乙奎醚對大白兔耳微循環(huán)的影響[J].蛇志，2011，23（1）：9-10.

[15]董航，劉楊震，宇李霞，等.麻醉前應(yīng)用新型抗膽堿藥物對失血大鼠腸系膜微循環(huán)改變的影響[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2015，25（2）：12-14.