麻風(fēng)樹脂肪酸去飽和酶7基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王海波， 郭俊云， 劉 潮， 高 永

(1.曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，云南曲靖 655011； 2.曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院，云南曲靖 655011；3.云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南曲靖 655011)

麻風(fēng)樹脂肪酸去飽和酶7基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王海波1，2，3， 郭俊云2， 劉 潮1，2，3， 高 永1，2，3

(1.曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，云南曲靖 655011； 2.曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院，云南曲靖 655011；3.云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南曲靖 655011)

質(zhì)體型ω-3(Δ15)脂肪酸去飽和酶(FAD7)是多不飽和脂肪酸合成途徑中催化亞油酸(Δ9，12-C18 ∶2)形成α-亞麻酸(Δ9，12，15-C18 ∶3，ALA)的關(guān)鍵酶?；诼轱L(fēng)樹低溫鍛煉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)克隆到麻風(fēng)樹FAD7基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為JcFAD7。結(jié)果表明，該cDNA序列全長(zhǎng)1 796 bp，完整開放閱讀框1 341 bp，編碼446個(gè)氨基酸，理論分子量為51.1 ku，等電點(diǎn)為8.92。序列分析表明，JcFAD7編碼蛋白包含膜結(jié)合FAD蛋白的4個(gè)跨膜區(qū)、2個(gè)膜嵌合區(qū)、1個(gè)亞鐵血紅素結(jié)合基序及3個(gè)組氨酸簇等特征區(qū)域。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，麻風(fēng)樹 JcFAD7 蛋白與芍藥(Paeonialactiflora)的親緣關(guān)系最近。

麻風(fēng)樹；脂肪酸去飽和酶7(FAD7)；基因克??；生物信息學(xué)分析

麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)為喜溫植物，原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)[1-2]，可形成優(yōu)勢(shì)種群落，現(xiàn)廣布于25°N～25°S之間，在我國(guó)云南、廣西、四川、廣東、海南等省(區(qū))多有野生種分布[2-3]。因其種子具有含油量高、油質(zhì)好、可生產(chǎn)生物柴油等優(yōu)點(diǎn)，成為具有巨大開發(fā)潛力的能源樹種。溫度是影響麻風(fēng)樹地域分布的主要限制因素，10 ℃以下低溫對(duì)麻風(fēng)樹有致命的傷害[4-5]，可嚴(yán)重影響麻風(fēng)樹的產(chǎn)量、分布及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，弄清麻風(fēng)樹低溫冷害與抗冷性機(jī)制，進(jìn)而培育抗冷新品種，對(duì)于麻風(fēng)樹的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究都有重要意義。

細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性是細(xì)胞乃至整個(gè)植物體賴以生存的基礎(chǔ)[6]，細(xì)胞膜不僅是植物低溫傷害的原初部位，也是植物細(xì)胞感受低溫的首要結(jié)構(gòu)元件。大量研究證實(shí)，膜系中脂肪酸的不飽和度或膜流動(dòng)性與植物抗冷性密切相關(guān)。膜脂的不飽和脂肪酸比例越大，膜流動(dòng)性越強(qiáng)，植物的相變溫度越低，抗冷性越強(qiáng)[7-8]。高等植物不飽和脂肪酸生物合成始于質(zhì)體基質(zhì)中的棕櫚酰-ACP(palmitoyl-ACP，C16 ∶0)和硬脂酰-ACP(stearic-ACP，C18 ∶0)，硬脂酰-ACP被質(zhì)體中可溶性硬脂酰-ACP去飽和酶(stearic-ACP desaturase，簡(jiǎn)稱SAD或FAD1)催化形成油酰-ACP(oleic-ACP，Δ9-C18 ∶1)[9]。棕櫚酰-ACP與油酰-ACP隨后繼續(xù)在質(zhì)體內(nèi)或被運(yùn)往內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成甘油酯，而棕櫚酰-ACP被定位于質(zhì)體膜上的棕櫚酰-ACP去飽和酶(palmitoyl-ACP desaturase，簡(jiǎn)稱FAD4或FAD5，屬ω-6系列的膜整合蛋白)催化形成棕櫚油酰-ACP(palmitoleoyl-ACP，Δ9-C16 ∶1)。單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，簡(jiǎn)稱MUFA)分別由與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)體膜結(jié)合的ω-6(Δ12)、ω-3(Δ15)脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase，簡(jiǎn)稱FAD)作用進(jìn)一步去飽和，生成多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，簡(jiǎn)稱PUFA)的甘油酯[10]。催化多不飽和脂肪酸生成的脂肪酸去飽和酶主要有5種：FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8，它們都屬于膜整合蛋白(FAD2、FAD3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，F(xiàn)AD6、FAD7和FAD8定位于質(zhì)體膜)，可分為ω-6型(也稱為Δ12型)(包括FAD2、FAD6)、ω-3 型(也稱為Δ15型)(包括FAD3、FAD7、FAD8)兩大類[11-12]。FAD7以NADPH-鐵氧還蛋白為電子供體，催化亞油酸(Δ9，12-C18 ∶2)形成α-亞麻酸(Δ9，12，15-C18 ∶3，簡(jiǎn)稱ALA)[13]。本研究利用GenBank中麻風(fēng)樹低溫鍛煉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[14-15]，篩選并克隆到麻風(fēng)樹FAD7基因(JcFAD7)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究JcFAD7基因的結(jié)構(gòu)與功能及該基因在麻風(fēng)樹三烯脂肪酸形成中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試麻風(fēng)樹種子采自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的麻風(fēng)樹種子，先用1.5% CuSO4消毒20 min，再用無(wú)菌水漂洗5次，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中吸漲24 h[16]。將吸漲的種子在無(wú)菌水中漂洗3次，播于墊有5層用無(wú)菌水濕潤(rùn)的濾紙的白瓷盤(24 cm×16 cm)中，于相對(duì)濕度75%、晝—夜溫度26 ℃—20 ℃、光—暗周期16 h—8 h的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。之后將發(fā)芽的種子播于消毒的培養(yǎng)土中并于同樣恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d至第2張真葉展開。取第2張真葉材料，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。

1.2 菌株與主要試劑

大腸桿菌Trans1-T1(DH5α)菌株，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；TransZol Up、DNase I、TransStartTaqDNA聚合酶、氨芐青霉素(Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye，即已加6×loading buffer，PCR產(chǎn)物可直接上樣電泳)、TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1 Cloning Kit、Trans 2K Plus II DNA Marker，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成和測(cè)序由深圳華大基因有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取及第1鏈cDNA的合成 取0.2 g麻風(fēng)樹葉片材料，按照王海波等的方法[13]，利用TransZol Up試劑提取并純化總RNA。以Anchored Oligo(dT)18為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix合成第1鏈cDNA。

1.3.2 麻風(fēng)樹JcFAD7基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 以與麻風(fēng)樹同科的植物蓖麻(Ricinuscommunis)FAD7全長(zhǎng)mRNA序列(L25897.1)為種子序列，對(duì)GenBank中麻風(fēng)樹低溫鍛煉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GenBank登錄號(hào)：GAHK00000000.1)的45 171條Unigenes序列進(jìn)行本地BLAST，得到麻風(fēng)樹JcFAD7基因的序列CL1490.Contig2_JC-CK_1A(GAHK01004476.1，2 035 bp)。分析表明，該序列包含全長(zhǎng)開放閱讀框(ORF)(1 341 bp)。以此序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA克隆引物，并送深圳華大基因有限公司合成。引物序列：上游F，5′-CTACAGACGATAGAGAAC-3′；下游R，5′-GAACAAATGATAGGATAC-3′。以“1.3.1”節(jié)中的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用TransStartTaqDNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min→(94 ℃ 30 s，48.8 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán))→72 ℃ 20 min。擴(kuò)增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit從瓊脂糖凝膠中回收目的基因片段(1 796 bp)，并與克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂LB抗性平板(LB-Amp++IPTG+X-gal)，過(guò)夜生長(zhǎng)，挑取白斑菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽(yáng)性克隆取名為pEASY-T1-JcFAD7，并送深圳華大基因有限公司，利用pEASY-T1質(zhì)粒上的M13F、M13R通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.3 麻風(fēng)樹JcFAD7基因的生物信息學(xué)分析 利用 BioEdit 軟件將JcFAD7 cDNA序列翻譯成氨基酸序列，利用在線工具ProtParam計(jì)算蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)。利用在線工具TMHMM與Proscale檢測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)與親/疏水特性。從GenBank下載其他物種FAD7氨基酸序列，利用ClustalX進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA軟件通過(guò)鄰接法(neighbour-joining，簡(jiǎn)稱NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用自展法(Bootstrap method)進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻風(fēng)樹JcFAD7基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

以麻風(fēng)樹葉片cDNA為模板，擴(kuò)增JcFAD7基因cDNA的全長(zhǎng)序列，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度約 1.8 kbp(圖1-A)。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆(圖1-B)。挑取陽(yáng)性克隆過(guò)夜搖菌，并用M13通用引物進(jìn)行測(cè)序。

2.2 麻風(fēng)樹JcFAD7基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)測(cè)序分析，本研究克隆的麻風(fēng)樹JcFAD7基因的cDNA序列全長(zhǎng)1 796 bp，包含1個(gè)完整的開放閱讀框(1 341 bp)，編碼446個(gè)氨基酸(圖2)。將JcFAD7編碼框與其基因組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JcFAD7基因包含8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子。ProtParam分析結(jié)果顯示，JcFAD7編碼的蛋白質(zhì)分子量為 51.1 ku，理論等電點(diǎn)為8.92。TMHMM與Proscale分析表明，JcFAD7蛋白存在6段明顯的疏水區(qū)域，與4段跨膜α-螺旋區(qū)、2段膜嵌合α-螺旋區(qū)相對(duì)應(yīng)(圖3)。另外研究表明，該蛋白質(zhì)在N端、C端都不含信號(hào)肽，但N端存在1個(gè)亞鐵血紅素結(jié)合基序。

將克隆的麻風(fēng)樹JcFAD7基因翻譯的氨基酸序列與 GenBank 下載的其他高等植物的FAD7進(jìn)行序列相似性比對(duì)，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。FAD7蛋白的物種名稱及GenBank登錄號(hào)：擬南芥(Arabidopsisthaliana)，NM_111953.2；垂枝樺(Betulapendula)，AY135565.1；二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)，XM_003558109.2；歐洲油菜(Brassicanapus)，F(xiàn)J985690.1；亞麻薺(Camelinasativa)，XM_010466516.1；茶(Camelliasinensis)，KC847167.1；黃瓜(Cucumissativus)，NM_001287475.1；播娘蒿(Descurainiasophia)，EF105163.1；油棕(Elaeisguineensis)，XM_010939556.1；美洲油棕(Elaeisoleifera)，EU057620.1；猴面花(Erythrantheguttata)，XM_012994633.1；巨尾桉(Eucalyptusgrandis)，XM_010032901.1；大豆(Glycinemax)，GQ144962.1；野大豆(Glycinesoja)，L22965.1；草棉(Gossypiumherbaceum)，KF460118.1；陸地棉(Gossypiumhirsutum)，KF460144.1；雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)，NM_001309351.1；向日葵(Helianthus annuus)，AY254858.1；蘋果(Malus domestica)，NM_001293987.1；蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)，XM_003604610.1；川桑(Morus notabilis)，XM_010103126.1；蓮(Nelumbo nucifera)，XM_010266313.1；美花煙草(Nicotiana sylvestris)，XM_009799172.1；煙草(Nicotiana tabacum)，D79979.1；茸毛煙草(Nicotiana tomentosiformis)，XM_009596074.1；橄欖(Olea europaea)，DQ788674.1；芍藥(Paeonia lactiflora)，KP271031.1；胡楊(Populus euphratica)，XM_011006458.1；馬齒莧(Portulaca oleracea)，DQ991249.1；蓖麻(Ricinus communis)，L25897.1；芝麻(Sesamum indicum)，U25817.1；油桐(Vernicia fordii)，AF200717.1；豇豆(Vigna unguiculata)，EU180596.1；葡萄(Vitis vinifera)，XM_002273738.2；玉米(Zea mays)，NM_001279611.1；麻風(fēng)樹(Jatropha curcas，登錄號(hào)暫缺)。結(jié)果顯示，單子葉植物如二穗短柄草與雙子葉植物明顯聚類為2支，說(shuō)明兩者的FAD7基因在進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在雙子葉植物中，不同科的植物分別聚類為單獨(dú)1支，如豆科(Leguminosae)的大豆、蒺藜苜蓿等，茄科(Solanaceae)的煙草、美花煙草等，大戟科(Euphorbiaceae)的油桐、蓖麻等，十字花科(Brassicaceae)的擬南芥、油菜、播娘蒿等。大戟科的麻風(fēng)樹未與近科物種蓖麻聚類在一起，而與芍藥的親緣關(guān)系更近，序列相似性為 74.6%。

3 討論

決定高等植物抗冷性強(qiáng)弱的主要是三烯脂肪酸(簡(jiǎn)稱TA，即C18 ∶3、C16 ∶3)的含量。目前，催化三烯脂肪酸合成的關(guān)鍵ω-3去飽和酶FAD3、FAD7、FAD8的研究也在逐漸深入。根據(jù)電子供體不同可將ω-3脂肪酸去飽和酶分為2類：一類為FAD3，定位于植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以細(xì)胞色素b為電子供體，作用于磷脂酰甘油(PG)或其他磷脂；另一類為FAD7、FAD8，定位于植物細(xì)胞的質(zhì)體，以鐵氧還蛋白為電子供體，作用于磷脂酰甘油、硫脂和半乳糖脂。FAD3、FAD7、FAD8都具有相似的蛋白序列結(jié)構(gòu)特征，氨基端與羧基端位于膜的外側(cè)，保守性低，中間部位相對(duì)保守，包含4個(gè)跨膜區(qū)域及2段膜嵌合區(qū)，在細(xì)胞質(zhì)一側(cè)存在3個(gè)極度保守的組氨酸簇(HX3/4HH、HX2/3HH、HX2/3HH)與Fe2+形成酶的催化活性中心[17](圖5)。

FAD3基因編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型ω-3脂肪酸去飽和酶，負(fù)責(zé)質(zhì)體內(nèi)膜膜脂之外所有不飽和甘油酯的合成。目前已經(jīng)從擬南芥、油菜、大豆、紅花菜豆(PhaseoluseoccineusL.)、芝麻、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)、亞麻(Linumusitatissimum)、菠菜(Spinaciaoleracea)、番茄(Lycopersiconesculentum)、歐洲白樺(BetulapendulaRot)、白蘇[Perillafrutescens(L.) Britt]、紫蘇[Perillafrutescens(L.) Britton.]、云杉(PiceaasperataMast)、油桐[Verniciafordii(Hemsl.) Airy Shaw]、野毛豆(GlycinesojaSieb. Et Zucc.)、挪威云杉[Piceaabies(L.) Karst.]、麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)、油橄欖等植物中分離到FAD3基因。Kodama等研究表明，隨著溫度的降低，植物體內(nèi)FAD3 mRNA含量增加，進(jìn)而亞麻酸的比例提高，而且FAD3基因的響應(yīng)可能依賴于翻譯后水平的調(diào)控，涉及蛋白質(zhì)的磷酸化共價(jià)修飾調(diào)節(jié)作用[18]。Yu等在番茄中過(guò)表達(dá)FAD3基因，經(jīng)過(guò)4 ℃低溫處理后，轉(zhuǎn)基因番茄葉片中亞麻酸含量增加，植株地上部分生物量高于對(duì)照植株，葉片中葉綠體膜系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)和所有亞細(xì)胞器的完整性均高于對(duì)照植株[19]。FAD7、FAD8為FAD3的質(zhì)體型同工酶。FAD7基因的表達(dá)不受溫度的調(diào)控，而FAD8基因則屬于溫度敏感型表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平都受到調(diào)控，而酶活性的調(diào)控區(qū)域主要在FAD8的羧基末端。目前已從擬南芥、油菜、甘藍(lán)、向日葵、玉米、歐芹(Petroselinumcrispum)、蓖麻、白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)、新疆野蘋果[Malussieversii(Ledeb.) Roem.]、大豆、芥菜、萊茵衣藻(ChlamydomonasreinhardtiiD.)、播娘蒿、黃瓜、洋桔梗(EustomagrandiflorumShinn.)、芝麻、仙客來(lái)(CyclamenpersicumMill.)等植物中分離到FAD7基因。Kodama等將從擬南芥中克隆的葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶基因(FAD7基因)導(dǎo)入煙草中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中十六碳三烯酸、十八碳三烯酸含量提高，其前體物質(zhì)含量相應(yīng)減少，在1 ℃低溫下表現(xiàn)出明顯的抗寒性。表明FAD7基因在葉綠體中主要負(fù)責(zé)葉組織中三烯脂肪酸的形成，同時(shí)也有力地證明了三烯脂肪酸水平的提高對(duì)植物耐寒性有非常重要的作用[20]，這與Dominguez等研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)FAD7基因番茄植株的抗寒性提高的結(jié)果一致[21]。1994年，Gibson等首次分離到FAD8基因，并進(jìn)一步分析了FAD8、FAD7基因的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，結(jié)果表明，與其他已知去飽和酶基因及FAD7相比，在正常條件下，F(xiàn)AD8 mRNA表達(dá)水平較穩(wěn)定，但在低溫條件下，其表達(dá)水平會(huì)顯著升高，證明FAD8基因?qū)儆诘蜏卣T導(dǎo)基因，與植物的抗冷性直接相關(guān)[22]。目前，已經(jīng)從擬南芥、玉米、秈稻(OryzasativaL. ssp.indicaKato)、白樺、豇豆、油菜、馬齒莧、播娘蒿等植物中分離到FAD8基因。Wang等將FAD8基因在水稻中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因品系中十六碳三烯脂肪酸和亞麻酸含量均增加，2 ℃處理7 d后，轉(zhuǎn)基因植株受損傷程度明顯低于對(duì)照植株[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，植物組織中不飽和脂肪酸含量一般占脂肪酸總量的75%以上，而植物組織的不飽和脂肪酸組成在很大程度上受脂肪酸去飽和酶種類和數(shù)量的調(diào)控，深入了解脂肪酸去飽和酶的種類、數(shù)量及其編碼基因的各種性質(zhì)對(duì)于定向改變植物的脂肪酸組成具有重要的理論和實(shí)際意義。本研究首次克隆到能源植物麻風(fēng)樹的FAD7基因，該基因?yàn)榭刂痞?亞麻酸系列多不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶基因，深入研究該基因的結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)方式對(duì)于闡明麻風(fēng)樹不飽和脂肪酸與抗冷性的關(guān)系具有較好的指導(dǎo)作用。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.008

2015-11-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31460179)。

王海波(1980—)，男，山西長(zhǎng)治人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。Tel：(0874)8987890；E-mail：bocai0406@163.com。

Q785

A

1002-1302(2017)02-0031-05

王海波，郭俊云，劉 潮，等. 麻風(fēng)樹脂肪酸去飽和酶7基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：31-35.